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我们来聊聊液相色谱方法开发

发布时间:2018-05-16 11:01:27
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这次和大家探讨一些关于HPLC方法学开发的问题。当然,这是很久以前的思路,在今天看来是比较幼稚的,但是,如果能够给大家一点哪怕一点点启示也是好的。当然文章有很多缺陷,也希望大家批评。

高效液相色谱在极性的角度可以分成正相色谱分析和反相色谱分析。反相色谱分析一般使用水-甲醇-乙腈体系,一般选用C8,C10,C18 柱子,主要使用C18键合相柱子。非极性物质一般用氯方-正己烷体系。因为qingqingcao没有做过正相HPLC分离,所以,我们主要关注反相HPLC分析。

色谱柱的选择

当然,选用的色谱柱一般就是C18柱。长度呢?如果分析的物质复杂,那么可以选取长一些的,比如250mm╳4.6mm╳5μm。保证其分离度。 如果物质不是很复杂,那么选取150mm╳4.6mm╳5μm的色谱柱,可以有效地缩短分析时间。

检测器的选择

紫外检测器是zui通用的检测器之一,所以,本文均以紫外检测器做说明。对于需要分析的物质,做全波长扫描,由于物质的不同官能团,他们会在不同的地方有吸收。通过综合选取大家都有吸收的波长。选择波长需要有权衡。同时也可以用一些特殊的波长,避免杂质的吸收,也可以提升测试准确度。或者使用双波长的方法。

流动相的选择

对于选取流动相,首先实验一下样品的溶解度。样品在水中,甲醇,乙腈中溶解程度。如果,很容易溶解在水中,这就告诉我们,流动相选取,可能有机相要少些,比方说测试维生素C,其极性很强,流动相中有机相比例不能多。(为了保护色谱柱,有机相比例一般不少于8% )如果,样品不太容易溶解在水中,那么有机相的比例应高些,比方像维生素E,就可以用90% -95% 的甲醇体系。

其次是样品的酸碱度。我们知道,C18色谱柱流动相pH在2-8 之间。太酸,太碱都可能损坏色谱柱。流动相pH值对于分离有一定作用,所以,酸性物质,一般流动相酸一些,碱性物质可能碱一些。

对于几种物质的分离。如果不是太多的物质,用等度方法会比较好。流动相一般开始选用20mM磷酸缓冲盐-乙腈体系。(pH一定,流速一定)。因为乙腈洗脱好,而且粘度低。通过水相-有机相的比例的改变,观察各色谱峰的分离情况。这样可以运用无限夹逼法找到zui合适的值。比方说,35:65(ACN:磷酸盐)达到分离,但是还是有部分叠加,那么就微调即可。当然还要考虑到分析时间问题。不要为了完全分离而牺牲了分析时间。所以,在色谱分析,有一个k值(容量因子)。κ∈(2,20)

如果真的无法改变,那么可以试着微调pH值,来分离。当然,由于乙腈毒性强,所以通过一定计算,用甲醇同等地接替乙腈。

如果有些物质很靠近死体积,那么需要考虑添加0.02mM离子对试剂,加强物质的保留能力。

流速

一般液相流速在0.8-1.4ml/min。shou选1.0ml/min

柱温

柱温不影响色谱的分离,但是,相对稳定的温度,可以使得保留时间稳定。

进样量

手动进样,只有进样环。一般也就是20μL。自动进样的选择很多。但是,zuihao不要超过80μL。因为进样多,容易造成展宽。

分离物质的浓度

分离物质,不能够太浓也不能太稀。太浓,容易过载;太稀检测不出。具体还是根据检测器的响应来调整。

小结

HPLC分析,首先要找到合适的流动相。流动相既要保证分离,又要关心分析时间。流动相尽量使用毒性小一点的甲醇。根据样品和标准品的PH值进行调节流动相溶液酸碱度。

检测波长很重要,要懂得合适的波长。也就是说,这个单一波长可以分析出所有需要分析的物质。可以通过波长的调整,规避杂质峰的干扰。

温度和流速都对分离,影响不大。

分离条件摸索好后,就可以开展

1)线性浓度测试

2)精密度测试

3)样品测试

4)回收率测试

5)空白测试。

6)zui小检测限,zui小检测量

定量的工作比较简单,就是按照以上的思路去操作。那么一个项目就这么完成了。当然,这些需要我们的工程师们的努力和智慧。我希望写的这些东西,能够给初学者一点点启示,当然,如果有错误的话,希望不会误导大家。

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