人14-3-3蛋白酶联免疫试剂盒【试剂的准备和保存】
A. 人14-3-3蛋白标准品的稀释和使用：在使用前2小时内准备。将冻干品管内加入500ul样品稀释液，*溶解后取出250ul加入到750ul样品稀释液中，混匀后做倍比稀释。
稀释后的人14-3-3蛋白标准品在2小时内使用。

B．*标记人14-3-3蛋白人14-3-3蛋白抗体工作液：在使用前2小时内准备。
1． 根据每孔需要0.1ml计算总的用量（实际配制时应多配制0.1-0.2ml）。
2． 按10ul*标记人14-3-3蛋白人14-3-3蛋白抗体加人14-3-3蛋白人14-3-3蛋白抗体稀释液990ul的比例配制工作液。轻轻混匀。

C．亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）工作液的准备：在使用前1小时内准备。
1． 根据每孔需要0.1ml计算总的用量（实配时应多配制0.1-0.2ml）。
2． 按10ul亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）加ABC稀释液990ul的比例配制工作液。轻轻混匀。

D. TMB工作液的准备：在使用前1小时内准备。取TMB显色液A 9份加TMB显色液B 1份，混匀后即为TMB工作液，切忌TMB工作液要避光保存，使用的过程中，避免接触金属器械。

人14-3-3蛋白酶联免疫试剂盒【操作程序】
1． 确定本次检测所需的已包被人14-3-3蛋白人14-3-3蛋白抗体的酶标板孔数目。
2． 将倍比稀释的人14-3-3蛋白标准品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为对照。处理后的标本按100ul每孔加入。
3． 酶标板加上盖，37℃反应90分钟。
4． 反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下。洗涤2次。
5． 将准备好的*人14-3-3蛋白人14-3-3蛋白抗体工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反应60分钟。
6． 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤3次，每次浸泡1分钟左右。
7． 将准备好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反应30分钟。
8． 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤5次，每次浸泡1-2分钟左右。
9． 每孔0.1ml依次加入TMB工作液，37℃避光反应，反应过程中，要经常的观察，当肉眼可见人14-3-3蛋白标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔差别不明显时，即可加入TMB终止液0.1ml/孔。（显色反应zui长不要超过30分钟）。
10． 用酶标仪在450nm测定O.D.值。
11． 根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了N倍，其实际浓度应该×N。

【注意事项】
1． 开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。
2． 配制各种试剂时，切记混匀！
3． 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。
4． 建议所有人14-3-3蛋白标准品、样本都做双份检测。
5． 要严格避免操作过程中酶标板干燥。干燥会使酶标板上生物成份迅速失活！
6． 为免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和试管。