需要而未提供的试剂和器材

1  .标准规格酶标仪。

2  .自动洗板机。

3,恒温箱

4  .系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，用多通道移液器。

5  .干净的试管和Eppendof管。

6  .用去离子水将25X洗涤缓冲液稀释25倍，成1X洗涤缓冲液。

注意事项

1  .使用前TMB显色液应为无色透明溶液，若发现颜色异常，请及时与厂家联系。

2  .用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。

3  要严格避免操作过程中酶标板干燥。干燥会使酶标板上生物成份迅速失活。

4  .为免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和试管。

5  .禁止混用不同批次试剂盒内的试剂。

6  .本公司提供的96孔酶标板是单条可拆型酶标板，用户可按需求使用；剩余的酶标板请 按保存条件贮存。

7  .揭封板膜和覆盖封板膜时应避免用力过大导致液体溅出。

洗板方法

手工洗板方法：吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水 纸，酶标板朝下用力拍几次；将1X洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据 需要，重复此过程数次。

自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

样品的准备和保存

样品如果不立即分析，应分装后冷冻保存，且避免反复冻融。

细胞培养上清一一离心去除沉淀，立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

血清一一用干净试管收集血液，室温凝固2小时，离心1000Xg 15分钟，收集血清。立即 分析或分装后-20℃冷冻保存。

血浆一一用干净试管收集肝素抗凝血液，30分钟内离心，1000Xg 15分钟，收集血浆。立 即分析或分装后-20℃冷冻保存。EDTA或柠檬酸盐抗凝血不适合。

细胞裂解液一一对于贴壁细胞，去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。 加入适量裂解液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常10 秒后，细胞就会被裂 解。对于悬浮细胞，离心收集细胞，用PBS、 生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量 裂解液，用枪吹打把细胞吹散，用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后， 10000—14000g 离心3-5分钟，取上清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

试剂的准备和保存

A. ACE标准品的稀释和使用：在使用前2小时内准备。

试剂盒提供2管标准品，每管10ng,每次使用1管。

1,  配制10,000pg/ml标准品：取1ml样品稀释液加入标准品管内，盖好后静置10分钟以 上，然后反复颠倒/搓动以助溶解。

2,  配制6000pg/ml标准品：取0.6ml 10,000pg/ml的标准品加入有0.4ml样品稀释液的

Eppendorf管中，混匀，做上标记。

3,配制3000pg/mlf 93.8pg/ml标准品：准备6只Eppendorf管，每管加0.3ml样品稀释 液，分别标记上 3000pg/ml, 1500pg/ml, 750pg/ml, 375pg/ml, 187.5pg/ml, 93.8pg/ml 。 取0.3ml 6000pg/ml的标准品加入标记3000pg/ml的管中，混匀后同样取出0.3ml ,加入 下一只管中。余同此类推，直到只样品管。

注意：已经稀释的标准品（10,000pg/ml）,应在12小时内使用。-20℃冷冻保存条件 下，2天内可以使用，但不得反复冻融。

1  .标记抗小鼠ACE抗体工作液的准备：在使用前2小时内准备。

1  .根据每孔需要100ul计算总的用量（实际配制时应多配制100ul-200ul）。

2  .按1ul标记抗小鼠ACE加抗体稀释液99ul的比例配制工作液。轻轻混匀。

C.亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）工作液的准备：在使用前1小时内准备。

1  .根据每孔需要100ul计算总的用量（实配时应多配制100ul-200ul）。

2  .按1ul亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）加ABC稀释液99ul的比例配制工作液。轻 轻混匀。

操作程序

己稀释好的ABC和TMB显色液在加入酶标板孔前都应预先在37℃中平衡至少30分钟。 试剂或样品稀释时，切不可忘记混匀 。每次检测都应该做标准曲线。用户须估计样品待测 因子的含量，决定适当的稀释倍数。

1  .确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显色 孔。总数=样品数+9；做双份检测时又2。其余重包装好放入冰箱中。

2  . 将 6000pg/ml , 3000pg/ml, 1500pg/ml, 750pg/ml, 375pg/ml, 187.5pg/ml, 93.8pg/ml 的

标准品各100ul依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为零孔。对于血清、 血浆、细胞裂解液或细胞培养上清，每孔加100ul已用样品稀释液稀释的样品。

1 .酶标板加上封板膜，37。。反应90分钟。

2 .反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几 下。不洗。

3 .将准备好的抗小鼠ACE抗体工作液按每孔100ul依次加入。（TMB空白显色孔 除外）。酶标板加上封板膜，37℃反应60分钟。

4 . 1X洗涤缓冲液洗涤3次，每次浸泡1分钟左右（每孔洗液至少300ul）。

5 .将准备好的ABC工作液按每孔100ul依次加入（TMB空白显色孔除外）。酶标板加封 板膜，37℃反应30分钟。

6 . 1X洗涤缓冲液洗涤5次，每次浸泡1-2分钟左右（每孔洗液至少300ul）。

7 .按每孔90ul依次加入已在37℃平衡30分钟的TMB显色液，37℃避光反应15-20分 钟（注意：显色时间供参考，因用户实验室条件差异，显色时间会有所不同。此 时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔差别不明显）。

8 .按每孔100ul依次加入终止液，此时蓝色立转黄色。

9 .用酶标仪在450nm测定O.D.值。

有两种设定空白对照的方案：

（1）将TMB空白显色孔（只加TMB显色液和终止液）设为对照。所有的标准品和样 品的吸光值减去TMB空白显色孔的吸光值后，在坐标纸上画出曲线，以吸光值作为 纵坐标，以浓度作为横坐标。

（2）将零孔设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去零孔的吸光值后，得到的数 据可以直接在坐标纸上画出曲线。

12.根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算。

应记住由于样品稀释了 N倍，其实际浓度应该XN。

1 .加样品和标准品，37℃反应90分钟。不洗。

2 .加标记抗体，37℃反应60分钟。1X洗涤缓冲液洗涤3次。

3 .加ABC, 37℃反应30分钟。1X洗涤缓冲液洗涤5次。

4 . TMB37℃反应 15-20 分钟。

5 .加入终止液，读数。

典型数据

TMB37℃反应15分钟。

（数据供参考，不同用户显色时间会有所不同）