TH-P1600 非洲猪瘟试剂盒诊断试剂盒-环保在线-手机站

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详细信息

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非洲猪瘟病毒荧光PCR核酸检测试剂盒说明书

【兽药名称】

通用名称：非洲猪瘟病毒荧光PCR核酸检测试剂盒

汉语拼音:Feizliouzhuwen Bingdu Yingguang PCR Hesuan Jianceshijihe

英文名称：African swine Fever Virus (ASFV) PCR Nucleic Acid Diagnostic Kit

商品名称：无

【主要成分与含量】试剂盒中含有如下组分:

试剂盒组分	含量
阳性对照	250μL/管×1管
阴性对照	250μL/管×1管
PCR反应液	850μL/管×1管
萌混合液	150μL/管×1管
说明书	1份/盒
【作用与用途】本试剂盒可用于血液、脾脏、肝脏、淋巴结、样品中非洲猪瘟病毒核酸的检测。扁桃体、肾脏、肌肉、环境样品等

【用法与判定】

1 用法

1.1待检样品釆集、保存及运输

1.1.1样品釆集

（1）活猪样品无菌采集抗凝血或血清5mL

（2）病死猪剖检样品或屠宰场剖检样品无菌采集死猪的牌、肺、肾、扁桃体、淋巴结、肌肉等组织样品。2〜8°C低温运至实验室用于检测。

（3）病猪污染的周边环境采集与病猪相关场所的粪便、饲料、污水样品。2〜8°C低温运至实验室用于检测。

1.1.2样品保存采集的样品在2〜8°C保存应不超过24小时，-70°C条件下保存，避免反复冻融。

1.1.3样品运输泡沫箱加冰袋后密封进行运输。包装和运输应符合农业农村部《高致病性动物病原微生物菌（毒）种或者样品运输包装规范》和交通运输部门关于危险品运输管理的有关规定。

1.2样品处理

1.2.1血液样品处理抗凝血样品置于离心管中，8000 r/min离心2分钟取上层血浆，编号待检。非抗凝血样品置于离心管中，待凝固后，8000 r/min离心2分钟取200μL上层血清，编号待检。

1.2.2组织样品处理取适量脾脏、肝脏、淋巴结、扁桃体、肌肉等组织，置于研磨器或研磨管中研磨，再加适量生理盐水混匀，制成约10%的组织匀浆，8000 r/min离心2分钟，取200μL上清于RNase/DNase-free无菌离心管中，编号备用。

1.2.3环境样品处理

1.2.3.1粪便、饲料样品处理方法取适量的粪便、饲料放入盛有PBS缓冲液的研磨管中研磨混匀，制成约10%的匀浆液.8000 r/min离心2分钟，取200μL上清于RNase/DNase-free无菌离心管中，编号备用。

1.2.3.2污水样品处理方法直接取200μL污水进行核酸提取。

1.3病毒核酸的提取用磁珠法或柱式法进行DNA核酸提取。

1.4荧光PCR反应：

1.4.1从试剂盒中取出荧光PCR反应液、酶混合液，室温融化后，2000 r/min离心5秒。设被检样品、阳性对照和阴性对照总和为n,则反应体系配制如下：

试剂体系

PCR 反应液 17× (n+1) μL

酶混合液 3× (n+1) μL

1.4.2在新的RNase/DNase-fire 1.5 ml离心管中加入上述试剂，充分混匀后瞬时离心。按照20μL/ 管分装量将试剂分装至荧光PCR反应管。

1.4.3在上述制备好的荧光PCR反应管中分别加入阴性对照、阳性对照各5μL、处理好的待测核酸各5μL,终体积25μL/管，盖好荧光PCR反应管盖，混匀后瞬时离心，转移到荧光PCR仪器上。

144将PCR反应管放置在荧光PCR仪样品槽中，在荧光PCR仪上运行以下程序：

步骤

条件

循环数

50, 1

预变性

℃3分钟

95 ℃： 8 秒 55 ℃： 8 秒

PCR扩増

荧光通道选择FAM,在PCR扩增阶段每个循环的55℃时采集荧光信号。设置扩增体系为25μL, 同时要选择passive reference和quencher为none的模式。（注：若荧光PCR仪（如AB17500）按说明书中的反应程序设置后因持温时间短无法运行，可将预扩增和PCR扩增条件变更为95C： 5秒 55°C： 30 秒）

2结果判定

2.1试验有效性判定

阳性对照有典型扩增曲线且Ct值≤30.且阴性对照无Cl值或无扩增曲线，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期。则判试验结果有效。否则，此次试验视为无效。

2.2样品判定

2.2.1阳性：样本检测结果Ct值≤35且有明显指数增长期，判定检出非洲猪瘟病毒核酸。

2.2.2可疑：样本检测结果Ct值在35〜38范围内。此时应对样本进行重复检测，如果重复实验结果Ct值仍在35〜38范围内，有明显指数增长期.则判定为阳性，否则为阴性。

2.2.3阴性：样本检测结果Ct值＞38或无Ct值，判定未检出非洲猪瘟病毒核酸。

【注意事项】（1）实验前请仔细阅读本试剂盒说明书，严格按照操作步骤执行，在操作过程中对时间、试剂体积等精确控制可以获得好的结果。

（2）实验室应严格按照有关规定分区管理，依照配液区-模板提取区-扩增区-分析区顺序进行基因检测。各区间人员、器材、试剂及空气流向应有严格要求。

（3）核酸提取有关耗村确保洁净、无DNase/RNase,提取过程尽量低温、快速，完成后进入下一步实验或冻保。

（4）对于顶部采光仪器要带新的一次性PE手套对荧光PCR管封盖，对于底部采光仪

器要避免徒手或使用过的手套接触荧光PCR管底，检测过程中使用不带荧光物质一次性乳胶手套。