英国Oxford 新一代超分辨荧光显微镜Nanoimager

英国Oxford Nanoimaging公司生产的产品超分辨荧光显微镜-Nanoimager 是由牛津大学Achillefs Kapanidis教授团队经过8年时间研发而成的，是一种新型的单分子显微镜，也是世界上一款无需校准、无需光学平台、超小型台式超分辨显微镜。Nanoimager突破了传统光学的衍射极限，分辨率可达20nm，是一台大视野单分子FRET显微镜。Nanoimager简单易用、设计紧凑，使用安全无害的一级激光，用户在普通的实验室桌面上即可获得高分辨率的单分子荧光图像 。适用于单分子示踪、活细胞成像、蛋白互作、3D成像等研究。

Nanoimager技术特征

超分辨率成像

♦ 支持同时双色成像和顺序四色成像

♦ 高能量带来高精度

♦ 三维成像

♦ 随机光学重建显微技术 (dSTORM)和光激活定位显微技术 (PALM)

√ 无需光学平台

√ 使用前无需校准

√ 操作简单方便

√ 便携式，体积小

√ 普通实验桌即可安置

√ 采用1级激光，使用安全

Nanoimager显微镜设计

♦ Nanoimager具有和传统显微镜不同的特殊设计。传统显微镜需要集成单分子检测功能的配件，同时也会带来配件的限制性，而Nanoimager是专门为单分子超分辨成像而设计，为了达到更高的效率而移除了多余的成像元件；
♦ 配置更加安全的一级激光,Nanoimager可在任何办公室、实验室和教室使用。相对于放置于暗室的大型显微镜,Nanoimager更加方便用户的使用；
♦ Nanoimager的显微镜单位面积小于A4纸；配套的激光器通过光纤连接至显微镜；

♦ 与定制的显微镜和传统的显微镜设计不同， Nanoimager始终保持校准状态。样品准备好后可以直接成像，无需花费时间进行调试和校正。
♦ Nanoimager的封闭式系统能够防止偏移发生并阻止灰尘和其他污染物进入，可以一直保持在正常工作状态。作为一款台式机， Nanoimager不需要传统显微镜昂贵的配套设施，无需额外配置温控房间、光学平台、激光室或暗室。

Nanoimager技术原理

Nanoimager采用PALM/dSTORM技术，利用单分子定位算法并结合光学系统艾里斑的形状，以超高精度（纳米量级）获得荧光分子的中心位置，然后用CCD将其信号进行采集转化最终得到分辨率为20nm的超分辨图像。

成像模式

相对于普通的Epifluorescence(EPI)/模式，Nanoimager有total internal reflection fluorescence (TIRF)/ highly inclined and laminated optical sheet (HILO)两种模式可自由切换。

EPI：激发较厚的样品（＞10um），信号噪声强，即传统模式。

TRIF：激发薄层样品（＜200nm），信号噪声弱，适用于膜表面成像。

HILO：激发样品厚度（＜10um），信号噪声较弱，适用于大部分成像。

应用领域

应用案例

1、单分子FRET

Nanoimager是一台用于大视野单分子荧光共振能量转移(smFRET)的商业化仪器。 FRET是一种两个荧光分子间非辐射性的能量转移方式，反映两者的分子间距。 FRET一般在2 – 10 nm的间距发生。 smFRET研究中，作为供体的荧光分子由激光激发，将能量转移至临近的受体荧光分子。被激发的受体将能量以荧光形式发散。供体与受体可以连接至同一个或者不同的分子。

smFRET可以用于测量核酸或者单个蛋白分子的分子内距离，也可以用于研究蛋白亚基间的相互作用；还可应用于研究药物对于酶结合位点的构象动力学的作用，或是神经退行性疾病中蛋白的聚集。 smFRET可以用于在单分子层面推到结合常数、反应途径与停滞时间而不受总体平均值干扰。

Nanoimager适用于smFRET的关键功能包括：同时双色成像；单分子散射光强度和总体平均的实时分析；视野中数千个单分子的高通量成像，以及用交替荧光激发 (ALEX) smFRET的功能来定量化学计量与FRET效率。图4是smFRET用于研究单个DNA霍利迪交叉的动力学。

2、单分子示踪

Nanoimager可以在两个通道同时示踪细胞或者纯化物样品中的单分子 (图5)，并计算扩散系数。细胞中分子的扩散系数可以被示踪，如酶或蛋白可以通过药物和抗生素的反应来示踪。低扩散率可以表示标记分子与另一分子或结构的相互作用或相结合。同时示踪两种标记了不同荧光分子的分子可以确定两者动态相互作用的水平。

Nanoimager可以直接反映纯化样品中荧光粒子的扩散率和预估大小，具有敏感性 (单荧光分子级别) 和特异性 (双色标记可以显著降低检测杂质的可能性)。

3、使用Nanoimager成像—更大的视野

Nanoimager的每个成像通道均有50 µm x 80 µm的大视野，而其他大部分单分子显微设备只有20µm x 20 µm的视野。视野中照明均匀，可以实现单分子或细胞的高通量成像并快速收集数据。
下图显示了以10倍于其他技术的速度对突变的大肠杆菌细胞的不同表型进行成像。为了获得不同表型的可靠的结果，需要对大量细胞进行比较。使用具有大视野，能够自动对焦和自动获取数据的Nanoimager可以显著加快整个实验速度和通量。将大视野与超分辨成像结合是Nanoimager的优势。