Configuration-specific Monoclonal Antibody Based 

Cdc42 Activation Assay Kit 

Catalog Number：80701 

20 assay

产品说明

       小G蛋白是从属于细胞调节因子中的一个超家族。Rho家族是小G蛋白中的一个亚家族，它在细胞运动、细胞分裂以及基因转录中发挥主要作用。而本试剂盒中的Cdc42就属于Rho亚家族中的一种， Cdc42参与生理活动过程中其分子结构会呈现出2种相互转换的形式：与GTP结合的激活状态和与GDP结合的非活性状态。

       目前Cdc42蛋白活性的检测主要是依据小GTP酶Cdc42可以与p21活化激酶（PAK）的p21结合区域（PBD）结合，使PAK活化从而发挥生物学功能，进而间接的进行Cdc42活性功能的监测。然而此方法在检测过程中存在着一定的局限性比如GTP水解成GDP的速度过快以及Cdc42-GTP结合蛋白与p21结合区域之间较低的亲和力，导致这种检测方法的重复性较差。

        纽斯特生物技术有限公司推出的Cdc42活性检测试剂盒主要是依据单克隆抗体能够特异性的识别Cdc42-GTP结合蛋白，而不识别Cdc42-GDP结合蛋白，进而简单并且快速的进行Cdc42的活性检测。同时试剂盒中的Cdc42-GTP单克隆抗体也可以进行免疫组化实验中细胞和组织中Cdc42的活性监测。每套试剂盒可以进行20次检测。

检测原理

     武汉纽斯特生物技术有限公司的Cdc42活性检测试剂盒主要是利用识别蛋白特异形态的Cdc42-GTP单克隆抗体特异性的去检测细胞提取物或者体外的（样品需要进行GTPγS活化处理）活性Cdc42-GTP的水平。简言之，特异性识别Cdc42活化构象的鼠单克隆抗体可以特异性结合细胞裂解液中的Cdc42-GTP活性蛋白，然后利用protein A/G将抗原抗体的结合物吸附下来，再利用特异性识别Cdc42活化构象的兔多克隆抗体进行免疫印迹分析进行检测。

试剂盒成分

1. 特异性识别Cdc42活性构象的鼠单克隆抗体（Anti-active Cdc42, Mouse MonoclonalAntibody (Catalog No. 26905)）：小管装--30ul (抗体浓度是1mg/ml)，抗体溶于PBS（pH7.4）并包含50%的甘油和0.05%的。此抗体可以特异性识别所有脊椎动物中的Cdc42-GTP。

2. Protein A/G agarose (Catalog No. 30301) ：小管装—400ul包含200ul Protein A/G agarose     和200ul 20%乙醇溶液。（使用时溶液需要充分混匀，再吸取）

3. 5X Assay/Lysis Buffer (Catalog No. 30303)：小瓶装—30mL包含250 mM Tris-HCl (pH 8.0),     750 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 5 mM EDTA, 5% Triton X-100。

4. 特异性识别Cdc42活性构象的兔多克隆抗体（Anti-Cdc42, Rabbit Polyclonal Antibody  (Catalog No.21010)）：小管装--30ul (抗体浓度是1mg/ml)，抗体溶于PBS（pH 7.4）并包含有   50%的甘油。

5. 100 X GTPγS (Catalog No. 30302) ：小管装—100ul (10 mM) ，实验中0.5mL细胞裂解液使用      5ul GTPγS标记。

6. 100 X GDP (Catalog No. 30304) ：小管装—100ul (100 mM) ，实验中0.5mL细胞裂解液使用5ul GDP标记。

储存条件

试剂盒的成分在试剂盒的有效期限内必须存放于4°C条件下保存。

试剂（试剂盒内不提供，由实验者自行配置）

1.  刺激和未刺激的细胞裂解物；

2.  蛋白酶抑制剂；

3.  4 °C 摇杆或者摇床；

4.  0.5 M EDTA (pH 8.0)；

5.  1 M MgCl2；

6.  2X reducing SDS-PAGE sample buffer；

7.  电泳和免疫印迹相关试剂；

8.  免疫印迹缓冲液TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05%

Tween-20)；

9.  免疫印迹封闭缓冲液 (TBST containing 5% 脱脂奶粉 or 3% BSA)；

10. PVDF或硝酸纤维素膜；

11.  二抗；

12.  ECL 检测试剂；

试剂制备

1X Assay/Lysis Buffer：实验前用去离子水将5X的Assay/Lysis缓冲液稀释成1X的缓冲液，并在使用前加入蛋白酶抑制剂如1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 µg/mL aprotinin（）。

样品处理

贴壁细胞

1. 培养细胞密度达到大约80%-90%之间（直径10 cm培养皿，~107个细胞），并用活性剂或抑制剂进行处理。

2. 吸去培养基并用冰冷的PBS洗涤两次。

3. 向细胞中加入1X Assay/Lysis缓冲液（每个直径10cm的组织培养皿中加入0.5-1mL）。

4. 将培养皿放置于冰上处理10-20分钟。

5. 用细胞刮棒把细胞从培养皿下分离下来。

6. 将细胞裂解物转入合适的管中并放置于冰上。

7. 如果核发生裂解，细胞裂解物可能会变得非常的粘稠并且难以吸取。当这种情况出现时，将细胞裂解物用27½的注射器针头来回吸取3-4次，以破坏基因组DNA，从而避免上述情况的出现。

8. 4°C 12000 g, 离心10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg总蛋白）并放置于冰上使用。如果样品不立即使用，请将处理后的样品存放于-70°C条件下。

悬浮细胞

1. 培养细胞并用活化剂或抑制剂进行处理。

2. 计数细胞后离心。

3. 吸去培养基并用冰冷的PBS洗涤两次。

4. 向细胞中加入1X Assay/Lysis缓冲液（每个直径10cm的组织培养皿中加入0.5-1mL）。

5. 反复吹打细胞进行裂解。

6. 将细胞裂解物转入合适的管中并放置于冰上。

7. 如果核发生裂解，细胞裂解物可能会变得非常的粘稠并且难以吸取。当这种情况出现时，将细胞裂解物用27½的注射器针头来回吸取3-4次，以破坏基因组DNA，从而避免上述情况的出现。

8. 4°C 12000 g, 离心10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg总蛋白）并放置于冰上使用。如果样品不立即使用，请将处理后的样品存放于-70°C条件下。

体外用GTPγS/GDP处理蛋白以用作阳性和阴性的对照

注意：在细胞体内环境条件下大约有10%的Cdc42被激活，而在体外用GTPγS处理大约有90%的Cdc42被激活。

1. 准备两个离心管，每个管中各加入0.5 mL的细胞提取物（如果是纯的Cdc42蛋白则每个管中加入的蛋白量为1ug）。

2. 每个管中加入20ul 0.5M EDTA(终浓度即为20 mM)。

3. 一个管中加入5ul的100X GTPγS（终浓度即为100 uM）作为阳性对照。另一个管中加入5ul的100X GDP（终浓度即为1 mM）作为阴性对照。

4. 将离心管置于30°C条件下反应30min并不断搅动。

5. 终止反应：将管置于冰上并加入32.5ul 1M MgCl2(终浓度即为60mM)。

检测步骤

Ι。活性Cdc42 Pull-Down实验

1. 等分0.5-1 mL的细胞裂解物至微量离心管中。

2. 向管中加入1mL的1X Assay/Lysis 缓冲液。

3. 向管中加入1ul的活性Cdc42单克隆抗体。

4. 用涡旋振荡仪将protein A/G凝胶柱充分混匀，然后快速的吸出20ul悬浮珠浆液加入离心管中。

5. 将管置于4°C条件下孵育1H，并轻轻的进行摇动。

6. 5000g，离心1分钟。

7. 弃上清，这一步要非常小心以避免珠子的损失。

8. 用0.5 mL的1X Assay/Lysis缓冲液洗涤珠子三次，离心并弃去上清。

9. 次洗涤后，小心的移去所有的上清。

10. 用20ul的2X SDS-PAGE样品缓冲液重悬样品。

11. 样品煮沸5min。

12. 5000g，离心10s。

II. 电泳和转膜

1. 取15ul样品/孔上样17%配体胶。

2. 按照制造商的说明进行SDS-PAGE。

3. 按照制造商的说明将凝胶蛋白转到PVDF或硝化纤维素膜。

III.免疫印迹反应和检测（所有步骤都是在室温下进行，并不断搅拌）

1. 将PVDF膜浸入99%甲醇15s，然后在室温放置5 min晾干。

注意：如果使用的是硝化纤维素膜，此步省略。

2. 封闭：用TBST缓冲液配制5%的脱脂牛奶或者3%BSA在室温下孵育1H进行封闭，并需要恒定振荡。

3. 孵育一抗：用TBST缓冲液配制的5%脱脂牛奶或3%BSA稀释特异性识别Cdc42活性构象的兔多克隆抗体（稀释比例为1:50-1:1000，主要根据样品中含有的Cdc42蛋白的量），室温下孵育1-2小时，或者4°C条件下过夜孵育。

4. 用TBST缓冲液洗涤膜三次/5min。

5. 孵育二抗：（例如羊抗兔IgG-HRP），用TBST缓冲液配制的5%脱脂牛奶或3%BSA按1:1000稀释比例稀释后使用，室温下孵育1小时并恒定振荡。

6. 用TBST缓冲液洗涤膜三次/5min。

7. 使用实验者所选择的检测方法进行显色如ECL显色法。

示例结果

下图展示的是武汉纽斯特生物技术有限公司的Cdc42活性试剂盒的典型结果。下面的数据仅供参考。

Cdc42活性分析。小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）用表皮细胞因子（EGF）处理（Lane 2）和未处理（Lane 1）。细胞裂解物用特异性识别Cdc42活性构象的鼠单克隆抗体(Cat. # 26905)孵育(上图)。活性Cdc42珠子颗粒用特异性识别Cdc42活性构象的兔多克隆抗体(Cat # 21010)进行免疫印迹实验。底部的图展示的是细胞裂解液的活性Cdc42的Western blot实验结果。（底图SDS-PAGE的上样量是上图SDS-PAGE上样量的5%。）