肌酸(Creatine)含量试剂盒(肌酸酶法)微板法

肌酸(Creatine)含量试剂盒(肌酸酶法)微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 肌酸含量（酶法）检测试剂盒说明书 （货号:WS3021W 微板法 96 样） 一、产品简介： 肌酸是一种内源性化合物，其功能是通过肌酸激酶的磷酸化使机体维持高的ATP/ADP 比率。肌酸补充剂是一种运动性能增强剂，亦用于治疗肌肉和神经退行性等疾病。因此 肌酸的检测在研究和开发中具有广泛的应用。 本试剂盒利用肌酸酶特异作用于肌酸生成肌氨酸，肌氨酸在肌氨酸氧化酶的作用下生 成过氧化氢，过氧化氢与显色剂反应呈现（粉）红色，该有色物质在520nm有吸收 峰，进而计算得到肌酸含量。 二、试剂盒组分与配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 11mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 液体 8mL×1 瓶 4℃保存 试剂三 粉体 mg×1 支 -20℃保存 临用前甩几下使液体落入底部， 再加 1.1mL 的蒸馏水溶解备用。 试剂四 粉体 mg×1 支 -20℃保存 临用前甩几下使液体落入底部， 再加 1.1mL 的蒸馏水溶解备用。 标准管 液体 1mL×1 支 4℃保存 临用前用蒸馏水稀释2倍， 即0.5mg/mL肌酸溶液 三、所需仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、可调式移液器、离心机、蒸馏水。 四、肌酸含量检测： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、 样本制备： ① 组织样本： 取约 0.1g 组织样本，加 1mL 的提取液研磨，粗提液全部转移到 EP 管中，12000rpm， 常温离心 10min，上清液待测。 ② 细菌/细胞样本： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 ③ 液体样品：澄清的液体可直接检测；若浑浊则离心后取上清液检测。本试剂盒仅供科研使用 2 2、上机检测： ①酶标仪预热 30min，设置温度在 37℃，设定波长到 520nm。 ②做实验前选取 2 个样本，找出适合本次检测样本的稀释倍数 D。 ③所有试剂解冻至室温，在 96 孔板中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 空白管 （仅做一次） 标准管 （仅做一次） 样本 10 蒸馏水 10 标准品 10 试剂一 100 100 100 试剂二 70 70 70 试剂三 10 10 10 混匀，37℃避光孵育 10min， 试剂四 10 10 10 混匀，37℃避光反应 30min，520nm 处读取吸光值 A（直到 A 值不变）， △A=A 测定-A 空白。 【注】：1. 测定管的 A 值若超过 1，可用蒸馏水对样本进行稀释，稀释倍数 D 代入计算公式。 2. 若△A 的值小于 0.005，可增加样本加样体积 V1（如由 10μL 增至 50μL，则试剂一相应 减少），或增加样本取样质量 W；则改变后的 V1 和 W 需代入公式重新计算。 3. 若样本自身含有高的肌氨酸含量，需增设一个样本自身对照： （即 10μL 样本+110μL 试剂一+70μL 试剂二+10μL 试剂三），△A=A 测定-A 对照。 五、结果计算： 1、按照质量计算： 肌酸含量(μmol/g)=(C 标准×V1)×△A÷(A 标准-A 空白)÷(V1÷V×W)×D×103÷Mr =3.81×△A÷(A 标准-A 空白)×D÷W 2、按细胞数量计算： 肌酸含量(nmol/104 cell)=(C 标准×V1)×△A÷(A 标准-A 空白)÷(V1÷V×500)×D×106÷Mr =7.63×△A÷(A 标准-A 空白)×D 3、按照体积计算： 肌酸含量(μmol/L)=(C 标准×V1)×△A÷(A 标准-A 空白)÷V1×D×106÷Mr =3813×△A÷(A 标准-A 空白)×D C 标准---标品浓度，0.5mg/mL； Mr---标准品分子量，131.13； V---提取液体积，1mL； V1---加入样本体积，0.01mL； 500---细胞数量，百万； D---稀释倍数，未稀释即为 1。