海藻糖-6-磷酸酯酶(TPP)试剂盒,微板法

海藻糖-6-磷酸酯酶(TPP)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 6-磷酸海藻糖酯酶（TPP）试剂盒说明书 （货号：WS2850W 微板法 48 样） 一、产品简介： 6-磷酸海藻糖酯酶（trehalose-6-phosphatephophatase，TPP，EC3.1.3.12）是海藻糖合 成的关键酶之一，催化海藻糖-6磷酸生成海藻糖。 本试剂盒利用 6-磷酸海藻糖酯酶催化底物 6-磷酸海藻糖生成海藻糖，海藻糖在海藻 糖酶的作用下分解成葡萄糖，接着在葡萄糖氧化酶作用下与特异显色剂反应生成有色物 质，通过检测该有色物质在 520nm 处的值，即可得出的 6-磷酸海藻糖酯酶活性大小。 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 8mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部，再加入 1.1mL 蒸馏水溶解备用。用不完的试剂 分装后-20℃保存，尽量不要反复冻融。 试剂三 液体 1mL ×1 支 -20℃保存 试剂四 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部，再加入 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 试剂五 液体 15mL×1 瓶 4℃保存 标准品 粉体 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱/金属浴、可调式移液器、研钵、冰。 四、6-磷酸海藻糖酯酶（TPP）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实 验样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本：称取约 0.1g 组织样本（水分足的样本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，冰 浴匀浆，12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。 ② 细菌/真菌样本： 先收集细菌或真菌到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌或真菌加入 1mL 提取 液；冰浴超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），室温晃动提取 30min， 8000rpm 室温（25℃）离心 10min，取上清。 【注】：若增加样本量，可按照提取液体积(mL) ：细菌或真菌数量（104个）为 1：500~1000 的比例提取 ③ 液体样本：澄清的液体样本，可直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 520nm，所有试剂解冻至室温（25℃）。 ② 在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 20 20 试剂一 60 80 试剂二 20 混匀，37℃孵育 30min 后，立即沸水浴或金属本试剂盒仅供科研使用 2 浴 5min 拿出。冷却至室温后再继续添加试剂。 试剂三 10 10 混匀，37℃孵育 15min。室温下于 12000rpm 离 心 10min，上清液待检测。 ③ 在 96 孔板中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 上步待测液 40 40 试剂四 10 10 试剂五 150 150 混匀，37℃避光孵育 20min，520nm 下读取吸光值 A，△A=A 测定-A 对照(每个样本做一个自身对照)。 【注】1.若 A 测定大于 1.5，可对③步的上清液用蒸馏水稀释，则稀释倍数 D 代入公式计算。 2.若△A 差值在零附近，可增加②步中样本的体积 V1（如增至 40μL，则试剂一相应减少）， 则改变后的 V1 需代入公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程为 y =0.1166x - 0.007；x 为标准品质量（μg），y 为△A。 2、按照蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克组织蛋白在每小时催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 TPP(μg/h/mg prot)=[(ΔA+0.007)÷0.1166×(0.11÷0.04)]÷(V1×Cpr)÷T=2358.5×(ΔA+0.007) ÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 酶活定义：每克组织每小时催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 TPP(μg/h/g 鲜重)=[(ΔA+0.007)÷0.1166×(0.11÷0.04)]÷(W×V1÷V)÷T=2358.5×(ΔA+0.007)÷W 4、按细菌或真菌密度计算： 酶活定义：每 1 万个细菌或真菌每小时催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 TPP(μg/h/104cell)=[(ΔA+0.007)÷0.1166×(0.11÷0.04)]÷(500×V1÷V)÷T=4.72×(ΔA+0.007) 5、按液体体积计算： 酶活定义：每毫升液体每小时催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 TPP(μg/h/mL)=[(ΔA+0.007)÷0.1166×(0.11÷0.04)]÷V1÷T=2358.5×(ΔA+0.007) V--提取液体积，1 mL；V1--样本体积：0.02mL；W--样本质量，g；T--反应时间，0.5 小时； 500--细菌或真菌数量，500 万；0.11--第②歩反应的总体积；0.04--第③歩反应上清液体积； Cpr--样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（1mg/mL）：从标准品管中称量取出 2mg 至一新 EP 管中，再加 2mL 蒸馏水混匀 溶解即 1mg/mL 的葡萄糖（母液需在两天内用且-20℃保存）。 2 把母液用蒸馏水稀释成以下浓度：0, 0.04,0.08,0.12,0.16, 0.2mg/mL。 3 第③歩显色反应阶段检测：40μL 标准品+10μL 试剂四+150μL 试剂五，37℃避光孵育 20min，520nm 下读取吸光值 A。依据结果制作标准曲线。