呋喃代谢物检测试剂盒介绍（四合一）

（四合一）

1 原理及用途

本套试剂盒有四种产品，采用间接竞争ELISA方法检测组织、蜂蜜、牛奶等样本中的呋喃类代谢物（AOZ、AMOZ、SEM、AHD），试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板、辣根酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂组成。检测时，加入标准品或样品溶液，样本中的呋喃代谢物和酶标板上预包被偶联抗原竞争抗呋喃代谢物抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含呋喃代谢物含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中呋喃代谢物的残留量。

2 技术指标

四种产品

加样模式统一：50ul样本/孔+50ul酶/孔+50ul抗体/孔。

反应模式统一：25℃，45min～15min；（具体见“6 酶联免疫试验步骤”）

前处理方法统一：即处理的一个样本可分别用于检测四种代谢物。做添加回收时也可以将四种高标准加入同一个样本中，一次性处理后分别用于检测四种代谢物。（具体见“5 样本前处理”）

2.1 试剂盒灵敏度及检测下限

*代谢物检测试剂盒：0.02ppb（ng/ml）

组织、肝脏…………………………0.04ppb

蜂蜜、牛奶、肠衣…………………0.04ppb

鱼/虾等水产品组织因有一定干扰，定量下限为0.1ppb

呋喃它酮代谢物检测试剂盒：0.05ppb（ng/ml）

组织、肝脏…………………………0.1ppb

蜂蜜、牛奶、肠衣…………………0.1ppb

鱼/虾等水产品组织因有一定干扰，定量下限为0.15ppb

*代谢物检测试剂盒：0.05ppb（ng/ml）

组织、肝脏…………………………0.1ppb

蜂蜜、牛奶、肠衣…………………0.1ppb

    鱼/虾等水产品组织因有一定干扰，定量下限为0.15ppb

*代谢物检测试剂盒：0.05ppb（ng/ml）

组织、肝脏…………………………0.1ppb

蜂蜜、牛奶、肠衣…………………0.1ppb

鱼/虾等水产品组织因有一定干扰，定量下限为0.15ppb

3 试剂盒组成

四种产品的“衍生化试剂、底物液A、底物液B、终止液、20X浓缩洗涤液、2X复溶液”成分统一，可以通用。

4 需要的器材和试剂

4.1 仪器：酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：单道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 试剂：乙酸乙酯、正己烷、钠、浓HCl、K₂HPO₄·3H₂O、亚硝基铁（K₂Fe（CN）₅（NO）_?2H₂O）、ZnSO₄·7H₂O

5 样本前处理

5.1 样本处理前须知：

    实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。实验之前须检查各种实验器具是否干净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。

5.2 配液：

配液1：0.36M亚硝基铁溶液（牛奶、奶粉样本）

11.9g亚硝基铁加去离子水至100ml溶解。

配液2：1.04M硫酸锌溶液（牛奶、奶粉样本）

    29.8g硫酸锌加去离子水至100ml溶解。

配液3：0.1M K₂HPO₄ 溶液

    称11.4g K₂HPO_4?3H₂O加去离子水溶解定溶至500ml。

配液4：1M HCL

    8.6mL浓HCL加去离子水定容至100mL。

配液5：1M NaOH溶液

    称取4g NaOH，加去离子水定容至100ml。

配液6：复溶液

    2×复溶液在使用前请按1:1稀释。

5.3 样本前处理步骤：

5.3.1 牛奶样本处理方法

1）取5ml样本于离心管中，加250ul 亚硝基铁溶液（配液1）振荡混合30秒，加250ul 硫酸锌溶液（配液2）振荡混合30秒，15℃4000转/分离心10分钟；

2）取上清1.1ml，加4ml去离子水、0.5 ml 1M 盐酸溶液和100μl衍生化试剂，振荡5分钟；

3）在37℃过夜孵育（约16小时）或50℃（超过50℃时会影响分层效果）水浴孵育3小时；

4）分别加入5ml 0.1M K₂HPO₄ 溶液，0.4ml 1M NaOH溶液和5ml的乙酸乙酯，振荡5分钟；

5）室温下4000转/分，离心10分钟；

6）取出2.5ml的上层液到另一个离心管中，50-60℃氮气或空气吹干；

7）用1ml正已烷溶解残留物，加入1ml复溶工作液充分振荡混合30秒；室温4000转/分，离心10分钟；

8）去除上层正已烷，取50μl下层液用于分析。

    样本稀释倍数为2

5.3.2 蜂蜜、组织、肠衣、肝脏样本处理方法

1）称取1±0.05g均质样于离心管中，加入4ml去离子水、0.5 ml 1M 盐酸溶液和100μl衍生化试剂，振荡5分钟；

2）后续接“5.3.1 牛奶样本处理方法，3）”

5.3.3 熟食样本处理方法

1）称取1±0.05g均质样于50ml离心管中，加入4.5ml甲醇和0.5ml去离子水，振荡2min，室温4000转/分，离心5分钟，去除全部液体；

2）加入5ml乙氰和5ml正己烷，振荡2min，室温4000转/分，离心5分钟，去除全部液体；

3）加0.5 ml 1M 盐酸溶液和100μl衍生化试剂，振荡5分钟；

    注：熟食的添加回收试验请在此步加入高标准。

4）后续接“5.3.1 牛奶样本处理方法，3）”

6 酶联免疫试验步骤

将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上, 洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解，每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

实验开始前需：将20×浓缩洗涤液用去离子水按1:19稀释成工作洗涤液。

6.1 编    号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

6.2 加样反应：加标准品或样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶标记物50µl/孔，再加抗体工作液50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻振荡5秒混匀，25℃反应45分钟。

6.3 洗    涤：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用工作洗涤液250µl/孔充分洗涤5次，每次间隔30秒，用吸水纸拍干。

6.6 显    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，轻轻振荡5秒混匀，25℃避光显色15分钟。

6.7终    止：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，终止反应。

6.8测吸光值：用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值（建议用双波长450/630nm）。测定应终止反应后在10分钟内完成。

7 结果分析

7.1 百分吸光率的计算

    标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以*个标准（0ppb）的吸光度值，再乘以*，即

A—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb标准溶液的平均吸光度值

7.2 标准曲线的绘制与计算