线虫unc-22突变基因
时间：2013-06-13 阅读：1051
线虫unc-22突变基因
实验原理
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA 连接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将载体分子与外源DNA分子进行连接。Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pMD18-T Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。将携带目的基因的T质粒转入大肠杆菌并对其进行蓝白斑筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。
1. 连接产物的转化
1） 取出-80℃保存的制备好的感受态细胞，冰上放置10～20min融化；
2） 加入5μl连接产物，轻轻混匀后冰上放置30～40min；
3） 42℃水浴中热击90s，轻轻放回冰上冷却2min；
4） 加入880µl LB液体培养基（不含氨苄*）和20µl葡萄糖，37℃摇荡培养1h；
5） 制备X-gal平板：取40μl X-gal、 4µl IPTG和56µl灭菌双蒸水混匀后均匀地涂布于含100µg/μl氨苄*的LB固体培养基平板上，放置1h以充分吸收；
6） 取适量的菌液（200µl），涂布于X-gal平板上，37℃培养1h后，倒置培养14～16h。
2. 重组质粒的筛选
2. 重组质粒的筛选
分别挑取白色和蓝色单菌落于5ml LB液体培养基中（含100µg/µl 氨苄*），37℃振荡过夜培养，用碱裂解法抽提质粒DNA。步骤如下：
1） 取适量菌液于1.5 ml的离心管中，瞬时离心，倒掉培养基，尽可能倒干净；
2） 加溶液I 100μl，涡旋重新悬浮沉淀；
3） 加溶液II 200μl，轻轻摇匀，在冰上放置3～5min使大肠杆菌裂解，释放质粒DNA；
4） 加预冷的溶液III 150μl，轻轻颠倒摇匀，出现白色絮状沉淀，在冰上放置3～5min停止裂解反应；
5） 4℃，12000rpm离心8min，转移上清至1.5ml离心管；
6） 以体积比1:1的比例加入400μl平衡酚和三氯甲烷，轻轻摇匀，静置2分钟；
7） 4℃，12000rpm离心10min，转移上清至1.5ml离心管；
8） 加入400μl三氯甲烷摇匀， 4℃，12000rpm离心5min；
9） 取上清加2倍体积预冷的无水乙醇，4℃，12000rpm离心8min；
10） 弃上清液,加75%乙醇1000μl洗涤2次，放置干燥；
11） 加50μl 双蒸水（含20μg/ml的 RNase），37℃保温2h，电泳检测（电泳中以蓝斑质粒DNA为对照，出现滞后带的确认为重组质粒）后-20℃保存备用。
3. 重组质粒的测序验证
将提取纯化后的质粒送至上海生物工程公司进行测序得到克隆基因的碱基序列，分析验证克隆的目的基因的正确性。