ELISA实验中的封闭液等常用试剂的配制

　ELISA实验中的封闭液小知识

ELISA的试剂盒说明上写封闭液用蔗糖溶液，一般是用BSA或酪蛋白的蛋白分子封闭空白位点，蔗糖封闭的原理：

1、ELISA实验中，蔗糖本身没有封闭作用;

2、封闭液一般是BSA、酪蛋白等或者是Tween等。

3、加蔗糖的主要目的是保护ELISA板子吸附（包被）的蛋白，起到“保护剂”的作用。

4、蔗糖溶液一般在ELISA板子经过BSA封闭后加，当然也有将蔗糖加到封闭液中同时进行处理;那一种更好需要你实验后来验证。但多数选择前者。

封闭剂还可用5%的脱脂乳（市售即可），0.4%的明胶，但是实验表明前者比较好，后者不容易洗干净未结合上的明胶。

封闭剂的原理就是与酶联板上未结合抗原或抗体的微孔中用封闭剂封闭上，结合抗体或抗原的时候就不会产生非特异结合了，不会影响实验的准确度。

tween的作用：虽然不能单独封闭，但和BSA在封闭时会起到清洗非特异性结合或结合不牢固的蛋白的作用，假如抗体包被在板上会出现YY-

ELISA实验中是以抗原和抗体的免疫反应为基础，ELISA试剂以及各种溶液如何配置?zui近刚做了下ELISA实验，把各种ELISA配置方法汇总如下：（1）　ELISA实验包被缓冲液（2）　ELISA实验洗涤缓冲液（2）　ELISA实验洗涤缓冲液（3）　ELISA实验稀释液;（4）ELISA实验终止液（5）ELISA底物缓冲液（6）ELISA实验TMB（四甲基联苯胺）使用液（7）　ELISA实验ABTS使用液（8）ELISC。

试剂

（1）　ELISA实验包被缓冲液（PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液）:

NaHCO3 1.59克

　NaHCO3　 2.93克

加蒸馏水至1000ml

（2）　ELISA实验洗涤缓冲液（PH7.4 PBS）：0.15M

KH2PO4 　　　　 　0.2克

Na2HPO4·12H2O　　2.9克

NaCl　　　　　 　　8.0克

　KCl　　　　　　　 　0.2克

Tween-20　0.05%　 0.5ml

加蒸馏水至1000ml

（3）　ELISA实验稀释液：

牛血清白蛋白（BSA） 0.1克

加洗涤缓冲液至100ml

或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10%使用。

（4）　ELISA实验终止液（2M　H2SO4）：

蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸（98%）21.7ml。

（5）　ELISA底物缓冲液（PH5.0磷酸棗柠檬酸）:

　0.2M Na2HPO4（28.4克/L） 25.7ml

0.1M 柠檬酸（19.2克/L）　　　　　 24.3ml

加蒸馏水50ml。

（6）　ELISA实验TMB（四甲基联苯胺）使用液:

TMB（10mg/5ml无水乙醇） 0.5ml

　底物缓冲液（PH5.5）　　　 10ml

　0.75%H2O2 32μl

　（7）　ELISA实验ABTS使用液:

　ABTS　　　　　　　　0.5mg

　底物缓冲液（PH5.5）　 1ml

　3%H2O2 2μl

　（8）ELISA实验封闭液：

　牛血清白蛋白（BSA） 5克

　加洗涤缓冲液至100ml。

　值得一提的是有的封闭液中含有脱脂奶粉，不适合长期保存。

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　为了保证ELISA实验的准确性，实验操作中加入的缓冲液和各组分一定要，将洗涤液加入酶标板中的时候防止加入的试剂混入另外一个酶标孔，严防交叉污染。