细菌总蛋白和膜蛋白提取方法
时间：2013-07-25 阅读：350
细菌总蛋白和膜蛋白提取方法
裂解液（pH 8.5-9.0）：50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA, 100 mM NaCl，0.5% Triton X-100，调pH值至8.5-9.0备用；
*；蛋白酶抑制剂PMSF；1% SDS溶液；Trizol裂解液；无水乙醇；异丙醇；0.3M盐酸胍；
疏水性蛋白提取液（非裂解液）：1% Triton X-114，150mM NaCl, 10mM Tris-HCl，1mM EDTA，调pH值至8.0备用。
实验设备
高速离心机；超声仪；透析袋；EP管；涡旋仪；水浴锅等。
实验步骤
1. 从新鲜样品中提取总蛋白（简易法）
1） 自配裂解液（pH 8.5-9.0）：50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA, 100 mM NaCl，0.5% Triton X-100，调pH值至8.5-9.0备用；用前加入100 μg/ml *，1μl/ml 的蛋白酶抑制剂PMSF。该裂解液用量为10-50ml 裂解液/1g湿菌体。
2） 将40ml 菌液在12000g，4℃下离心15分钟收集菌体，沉淀用PBS悬浮洗涤2遍，沉淀加入1ml裂解液悬浮菌体。
3） 超声粉碎，采用300w，10s超声/10s间隔，超声20min，反复冻融超声3次至菌液变清或者变色。
4） 1000g离心去掉大碎片，上清可直接变性后PAGE电泳检测，或者用1% SDS溶液透析后冻存。
缺点：Western blotting结果表明，疏水性跨膜蛋白提取效率有限。
2. 从Trizol裂解液中分离总蛋白
1） Trizol溶解的样品研磨破碎后，加氯仿分层，2-8℃下10000g离心15min，上层水相用于RNA提取，体积约为总体积的60%。
2） 用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1ml Trizol加入0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3min，2-8℃不超过2000g离心5min。
3） 将上清移至新的EP管中，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml Trizol加入1.5ml异丙醇，室温放置10min，2-8℃下12000g离心10min，弃上清。
4） 用含有0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤。每1ml Trizol加入2ml洗液，室温放置20min， 2-8℃下7500g离心5min，弃上清，重复洗涤2次。zui后加入2ml无水乙醇，涡旋后室温放置20min，2-8℃下7500g离心5min，弃上清。
5） 冷冻干燥5-10min，1%SDS溶液溶解，反复吹打，50℃温浴使其*溶解，2-8℃下10000g离心10min去除不溶物。
6） 替代方案：将3中的酚醇上清液移至小分子量透析袋中，在2-8℃的1% SDS溶液中透析3次，1000g离心10min去除沉淀，上清可直接用于蛋白实验。
3. 从新鲜样品中提取疏水性膜蛋白（Triton X-114去污剂法）
1） 配制疏水性蛋白提取液（非裂解液）：1% Triton X-114，150mM NaCl, 10mM Tris-HCl，1mM EDTA，调pH值至8.0备用。
2） 菌液于4℃条件下15000g离心15min收集菌体；用1ml 含有5mM MgCl2 的PBS洗涤3次，zui后于4℃条件下15000g离心15min收集菌体。
3） 菌体沉淀加入1ml冷提取液，于4℃条件下放置2h，17000g离心10min，去除沉淀取上清。
4） 将上述上清中的Triton X-114含量增加到2%，再加入20mM的CaCl2抑制部分蛋白酶活性，37℃条件下放置10min使其分层。室温下1000g离心10min使液相和去污相充分分层。
5） 将液相和去污相分开，分别用10倍体积的冷丙酮在冰上沉淀45min。
6） 于4℃条件下17000g离心30min，用去离子水洗涤沉淀3次。
7） 将沉淀溶解在1% SDS溶液中，测定蛋白浓度，比较液相和去污相中蛋白提取效率，一般是去污相中疏水性膜蛋白较多，适于进一步蛋白实验。
8） SDS-PAGE进一步分析液相和去污相的蛋白图谱。