人白细胞介素-8（IL-8）酶联免疫试剂盒
时间：2015-04-16 阅读：659
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上海远研生物科技有限公司 -
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人白细胞介素-8(IL-8)酶联免疫试剂盒使用说明
本试剂盒适用于以下样本的测试（黑底字体为适用样本）：
血清、血浆- 组织匀浆 –腹水 –细胞培养上清
本试剂盒仅供研究，不用于临床诊断
目录
- 实验原理
- 试剂盒组成
- 试剂盒保存
- 需要而未提供的试剂和器材
- 样本前处理
- 洗板方法
- 详细操作程序
- 操作总结
- 性能参数
- 实验原理：本试剂盒采用的是*双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定样品中人白细胞介素-8(IL-8)的水平。向预先包被了人白细胞介素-8(IL-8)单克隆抗体的酶标孔中加入白细胞介素-8(IL-8)，温育；温育后，加入*标记的抗IL-8抗体，再与链霉亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅与样品中人白细胞介素-8(IL-8)的浓度呈正相关。
2.试剂盒组成：
1 | 标准品（400 ng/L） | 0.5ml | 7 | 显色剂A液 | 3ml |
2 | 标准品稀释液 | 3ml | 8 | 显色剂B液 | 3ml |
3 | 酶标包被板 | 12孔×4条 | 9 | 终止液 | 3ml |
4 | 链霉亲和素-HRP | 3ml | 10 | 说明书 | 1份 |
5 | 20倍浓缩洗涤液 | 20ml | 11 | 封板膜 | 2张 |
6 | *标记的抗- IL-8抗体 | 1ml | 12 | 密封袋 | 1个 |
3.试剂盒保存
- 2-8℃下保存6个月，在-20℃下可以保存更长的时间。酶标板为真空包装，板条可以拆卸，拆开以后如一次不能用完，请放入提供的密封袋中，放入干燥剂，2-8℃保存，在一个月之内仍然有效。试剂不能反复冻融。
4．需要而未提供的试剂和器材
- 37℃恒温箱。
- 标准规格酶标仪。
- 精密移液器及一次性吸头
- 双蒸水或超纯水
- 干净的试管或Eppendof管
- 吸水纸
5样本前处理
- 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
b.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
c.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
d.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
e.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
f.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 - 洗板方法
- 手工洗板：先洗去酶标孔中的的液体，在吸水纸上拍干，然后每孔加入300μl稀释好的洗涤液，轻轻摇晃30秒，然后甩掉，在吸水纸上拍干，重复4-5次。
- 洗板机洗板：洗板机洗板比较便捷，但应操作熟练后使用。
- 详细操作程序
- 使用前请先将试剂盒在室温下平衡半小时。
- 标准品的稀释：（本试剂盒提供原倍标准品一支，用户请按照说明自行在小试管中倍比稀释）：
200 ng/L | （5号标准品） | 120μl的原倍标准品加入120μl的标准品稀释液 |
100 ng/L | （4号标准品） | 120μl的5号标准品加入120μl的标准品稀释液 |
50ng/L | （3号标准品） | 120μl的4号标准品加入120μl的标准品稀释液 |
25 ng/L | （2号标准品） | 120μl的3号标准品加入120μl的标准品稀释液 |
12.5 ng/L | （1号标准品） | 120μl的2号标准品加入120μl的标准品稀释液 |
- 根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。
- 加样：1）空白孔：空白对照孔不加样品，*标记的抗IL-8抗体，链霉亲和素-HRP，只加显色剂A&B和终止液，其余各步操作相同；2）标准品孔：加入标准品50μl，*-HRP50μl（标准品中已事先整合好*抗体，故不加）；3)待测样品孔:加入样本40μl，然后各加入抗- IL-8抗体10μl、链酶亲和素-HRP50μl，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37℃温育60分钟。
- 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。
- 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
- 显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。
- 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
- 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后10分钟以内进行。
9.根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。也可以使用各种应用软件来计算。
- 操作总结
准备试剂，样品和标准品
加入准备好的样品和标准品，*标记二抗和酶标试剂，37℃反应60分钟
洗板5次，加入显色液A、B，37℃显色10分钟
加入终止液
10分钟之内读OD值
计算
- 性能参数
- 批内差：CV＜10%
- 批间差：CV＜12%
- 检测范围：1ng/L→380ng/L