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腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性试剂盒

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腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性试剂盒
腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase,AGP)活性测定试剂盒说明书

分光光度法 25 管/24 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义

AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中,催化葡萄糖-1-磷酸与 ATP 反应生成淀粉合成的直接前体 ADPG,是植物淀粉生物合成的主要限速步骤。
腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性试剂盒测定原理

AGP 催化的逆向反应生成 G1P,在反应体系中添加的磷酸己糖变位酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成 6-磷酸葡萄糖酸和 NADPH,340nm 下测定 NADPH 增加速率,即可计算

AGP 活性。

需自备的的仪器和用品

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水
试剂的组成和配制

提取液:液体 30mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体 10mL×1 瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×1 支,4℃保存;临用前加入 250μL 蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
试剂三:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入 2mL 蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
试剂四:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入 3mL 蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
试剂五:粉剂×1 瓶,-20℃保存;临用前加入 3mL 蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
试剂六:粉剂×1 支,-20℃保存;临用前加入 250μL 蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
试剂七:粉剂×1 支,-20℃保存;临用前加入 250μL 蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

粗酶液制备

按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤:

1、分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2、试剂一置 30℃保温 10min 以上。

2、在 EP 管中按顺序加入下列试剂(如果一次性测定样本较多,可以将试剂一、二、三和四按比例配成混合液 1,将试剂一、五、六和七按比例配成混合液 2)

试剂名称(μL)    测定管
    
试剂一    100
    
试剂二    10
试剂三    50
试剂四    100
样本    20

混匀,30℃保温 15 min,置沸水浴中 1 min(盖紧,防止水分散失),冰浴迅速冷却

试剂一    300
试剂五    100
试剂六    10
试剂七    10

混匀后立即在 340 nm 波长下记录初始吸光度 A1 和 2min 后的吸光度 A2,计算 ΔA=A2-A1。

AGP 活性计算

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性试剂盒1、按样本蛋白蛋白浓度计算

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活性单位。

AGP(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T

=2813×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。2、按照样本鲜重计算

单位的定义:每 g 组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

AGP(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T

=2813×ΔA÷W

V 反总:反应体系总体积,7×10-4 L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103mol/L/cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.02 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量。

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