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294次α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-Arabinofuranosidase, α-L-Af) 试剂盒说明书
分光光度法 50管/24样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
α-L-Af 是一种能够水解非还原呋喃阿拉伯糖残基的糖苷酶类,使细胞壁阿拉伯半乳聚糖、
阿拉伯甘露聚糖等中性糖不断解离,促进果胶的增溶和降解。由于果实成熟过程中常常伴随
着阿拉伯糖的丧失,该酶活性在果实成熟软化中的研究具有重大意义。
α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-Arabinofuranosidase, α-L-Af) 试剂盒说明书 测定原理:
α-L-Af分解对硝基酚阿拉伯呋喃糖苷生成对-硝基苯酚,后者在 400nm有zui大吸收峰,通过
测定吸光值升高速率来计算 α-L-Af活性。
自备用品:
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸
馏水。
试剂组成和配制:
提取液:液体50mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:粉剂×1瓶,-20℃保存;临用前每瓶加入5mL蒸馏水,充分溶解备用;用不完的试
剂仍-20℃保存。
试剂二:液体15mL×1 瓶,4℃保存。
试剂三:液体50mL×1 瓶,4℃保存。
粗酶液提取:
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量
(104
个):提取液体积(mL)为500~1000:1 的比例(建议 500万细菌或细胞加入 1mL提
取液) ,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声 3s,间隔10s,重复30 次);
15000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g) :提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g组织,
加入 1mL提取液),进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-Arabinofuranosidase, α-L-Af) 试剂盒说明书 测定步骤:
1、 分光光度计预热 30min以上,调节波长至 400nm,蒸馏水调零。
2、样本测定(在 EP管中依次加入下列试剂):
试剂名称(μL) 测定管 对照管
试剂一 200
蒸馏水 200
试剂二 250 250
样本 50 50
迅速混匀,放入 37℃准确水浴30min
试剂三 1000 1000
充分混匀,400nm处测定吸光值 A,计算 ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。
α-L-Af活性计算:
标准条件下测定的回归方程为 y =0.00585x -0.0027;x 为标准品浓度(nmol/mL) ,y为吸光
值。
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg组织蛋白每 min产生 1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。
α-L-Af活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V反总]÷(V样×Cpr)÷T
=39.89×(ΔA+0.0027) ÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每 g组织每小时产生 1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。
α-L-Af活性(nmol/min/g鲜重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T
=39.89×(ΔA+0.0027) ÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每小时产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。
α-L-Af活性(nmol/min/104
cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V反总]÷(500×V样÷V样总)÷T
=0.08×(ΔA +0.0027)
Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;V反总:反应体系总体积,0.5mL;V样:加入反应体系中
样本体积,0.05mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;W:样本质量,g; 500:细胞或细
菌总数,500万;T:反应时间,30min。
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