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肉毒碱棕榈酰转移酶(CPT-1)试剂盒说明书
For Research Use only
仅供研究用
肉毒碱棕榈酰转移酶(CPT-1)试剂盒说明书货号:QYS-239012
分光光度法 50 管/48 样
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测
定测定意义:
肉毒碱棕榈酰转移酶是存在于线粒体内膜的一类酰基转移酶。可逆地催化从酰基辅酶 A
将酰基转移至 L-肉毒碱的反应,在转运脂肪酸通过线粒体内膜的过程中起重要作用。
肉毒碱棕榈酰转移酶(CPT-1)试剂盒说明书测定原理:
基于肉碱和脂酰辅酶 A 在丙二酰辅酶 A 存在与否的条件下,通过肉碱脂酰转移酶(CPT-I)
的作用,产生脂酰肉碱,并释放出巯基辅酶 A(COA-SH),与 Ellman 试剂 DN-TB 反应
后,产生黄色的 TNB。通过其吸收峰值得变化(412nm),来定量分析 CPT-1 的活性。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰、无
水乙醇和蒸馏水
试剂组成和配制:
试剂一:液体 50mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂二:液体 10mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂三:液体 1mL×1 支,-20℃保存;
试剂四:液体 55mL×1 瓶,4℃保存;
试剂五:粉剂×1 瓶,4℃保存;
试剂六:粉剂×1 支,-20℃保存;
肉毒碱棕榈酰转移酶(CPT-1)试剂盒说明书样本的前处理:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
① 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞,加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三,用冰浴匀
浆器或研钵匀浆。
② 将匀浆液于600g,4℃离心5min。
③ 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。
④ 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的CPT-1(此步可选做)。
⑤ 在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率 20
%或 200W,超声 3秒,间隔 10 秒,重复 30次),用于线粒体 CPT-1 测定。
测定步骤:
1、分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 412nm,蒸馏水调零。
2、样本测定
(1)在试剂五中加入 2mL 无水乙醇,混匀,再加入 44mL 试剂四,混匀,37℃(哺乳动物)
或 25℃(其它物种)孵育 5min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
(2)在试剂六中加入 2mL 蒸馏水,混匀,37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)孵育
5min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
(3)(3)在 1mL 玻璃比色皿中加入 40μL 样本、880μL 试剂五和 40μL 试剂六,
混匀,记录 412nm 处 20 秒时的初始吸光度 A1 和 2 分 20秒时的吸光度 A2,计算 ΔA=A2-
肉毒碱棕榈酰转移酶(CPT-1)试剂盒说明书
CPT-1 活性计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。
CPT-1(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109
]÷(V 样×Cpr) ÷T=880×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每 g 组织每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。
CPT-1(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109
]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=177.8×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。
CPT-1 ( nmol/min/104
cell ) =[ΔA×V 反 总 ÷ ( ε×d ) ×109
]÷ ( 500×V 样 ÷V 样 总 )
÷T=0.3556×ΔA V 反总:反应体系总体积,9.6×10-4
L;ε:TNB 摩尔消光系数,1.36×104
L /
mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.04 mL;V 样总:加入提取液体
积,0.202 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;
500:细胞或细菌总数,500 万。
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