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326次核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒(Nuclear-Cytosol Extraction Kit )
描述:本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取核蛋白和/或胞质蛋白,提取制备过程简便。制备的
核蛋白和胞浆蛋白能保持天然活性,并且纯度较高。提取的蛋白特别适于转录因子活性分析、凝胶阻滞实
验(gel shift assay, EMSA)、免疫共沉淀、酶活性测定,也适于 Western Blot 实验。
核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒(Nuclear-Cytosol Extraction Kit ) 组份
Kit compositions 50 extractions 100 extractions Storage
Cytosol Extraction Buffer A (CEB-A) 25 ml 50 ml 4
o
C, 1 year
Cytosol Extraction Buffer B (CEB-B) 1.5 ml 2×1.5 ml 4
o
C, 1 year
Nuclear Extraction Buffer (NEB) 5 ml 10 ml 4
o
C, 1 year
注意:不含蛋白酶抑制剂成分
实验的一般考虑
1. 所有的操作都应在冰浴中进行, 所有的试剂在实验前都要预冷。
2. 根据大致的细胞数,或者根据离心后的细胞体积(Packed cell volume, PCV),估计试剂加入的量。PCV
因细胞类型不同而有所差异。细胞数、PCV和加入试剂的关系参见下表:
培养皿直径 35 mm or 或 1 孔六孔板 60 mm 10 cm
培养皿面积 10 cm2
30 cm2
75 cm2
估计细胞数量 5 ×105
1 ×106
5 ×106
估计 PCV(μl) 5 10~20 50~100
加入 CEB-A (μl) 25 50~100 300~500
加入 CEB-B (μl) 1.2~1.5 3~6 3~6
加入 NEB (μl) 5~10 20 100
操作步骤
1. 裂解:(1) 培养细胞,PBS 洗涤细胞两次,估计大致的细胞数,或者估计离心后的细胞体积 PCV。每
1 ×106
个细胞加入 50~100μl 的 CEB-A,刮下细胞转移至预冷的 1.5ml 离心管;或者每体积 PCV细胞
加入 5 倍 PCV 体积的 CEB-A (即 10~20 μl PCV的细胞加 50~100μl 的 CEB-A),剧烈振荡重悬。(2) 组
织样本,称重后剪成小块,PBS 洗涤两次。通常每 10 mg 动物组织相当于 1×106
个细胞,需加入
50~100μl CEB-A,可根据组织重量按比例加入。在冰上用玻璃匀浆器或高速粉碎器破碎组织或细胞。
使用玻璃匀浆器通常需要 20~40 次上下抽动匀浆。
2. 裂解产物转移至预冷的 1.5ml 离心管,剧烈振荡 30 秒,冰浴10~15min,期间每 5 分钟振荡 15 秒。
3. 根据裂解物体积加入 1/20 体积的 CEB-B,振荡 10 秒,冰浴1min (加入 CEB-B 可去除核膜,适于制备
高纯度的核蛋白,但可使胞浆蛋白出现很少量的膜蛋白污染,欲制备高纯胞浆蛋白可省略此步骤)。
4. 1000g 4 o
C 离心 5 分钟,沉淀即是核粗提物,上清则是粗制的胞浆蛋白组分。
5. 胞浆组分制备:将上清转入另一预冷的离心管,12000g 4 o
C 离心,弃沉淀,取上清即得胞质蛋白组分,
于−20~−70ºC 保存。
6. 核粗提物处理:取第步骤 4 的核粗提物沉淀,加入 100μl CEB-A和 5 μl CEB-B 振荡10 秒洗涤沉淀,
冰浴 1min,1000g 5min 弃上清。再次加入 100μl CEB-A和 5 μl CEB-B 重复此步骤。
7. 核蛋白制备:在离心沉淀物(细胞核)中加入 50~100μl 预冷的 NEB (可选:使用前每 ml NEB 加入 1μL
DTT,5μL PMSF,5μl 蛋白酶抑制剂),剧烈振荡 15 秒,冰上30min,期间每 10 min 振荡 15 秒。12000g
5min,上清液含核蛋白成分,其中含有 25%的甘油;转入新管−20~−70ºC 保存。
8. 只需对提取的胞质组分进行蛋白定量(Braford或 BCA法),核蛋白纯度高但含量低,无需定量。
核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒(Nuclear-Cytosol Extraction Kit ) 说明:按照说明书操作,每 106
个细胞可得到 50-75μg 蛋白。试剂盒在不加入蛋白酶抑制剂时仍然工作良
好,但用户可自行加入。裂解时间是重要的,过短则细胞裂解不全导致蛋白产率低,裂解时间长则导致胞
浆蛋白有核蛋白污染。上述制备的蛋白样品与 2x SDS-PAGE 混合即可上样电泳。
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