在线交流

您好!欢迎前来咨询,很高兴为您服务,请问您要咨询什么问题呢?

可按Enter键发起咨询

齐一生物科技(上海)有限公司
免费会员

当前位置:首页   >>   资料下载   >>   核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒说明书下载

核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒说明书下载

时间:2016-6-29阅读:324
分享:
  • 提供商

    齐一生物科技(上海)有限公司
  • 资料大小

    23.3KB
  • 资料图片

  • 下载次数

    50次
  • 资料类型

    PNG 图片
  • 浏览次数

    324次
点击免费下载该资料

核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒(Nuclear-Cytosol Extraction Kit ) 
 
描述:本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取核蛋白和/或胞质蛋白,提取制备过程简便。制备的
核蛋白和胞浆蛋白能保持天然活性,并且纯度较高。提取的蛋白特别适于转录因子活性分析、凝胶阻滞实
验(gel shift assay, EMSA)、免疫共沉淀、酶活性测定,也适于 Western Blot 实验。  
 
核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒(Nuclear-Cytosol Extraction Kit ) 组份 
Kit compositions  50 extractions  100 extractions  Storage 
Cytosol Extraction Buffer A (CEB-A)  25 ml    50 ml  4 
o
C, 1 year 
Cytosol Extraction Buffer B (CEB-B)  1.5 ml  2×1.5 ml  4 
o
C, 1 year 
Nuclear Extraction Buffer (NEB)  5 ml  10 ml  4 
o
C, 1 year 
注意:不含蛋白酶抑制剂成分 
 
实验的一般考虑 
1.  所有的操作都应在冰浴中进行,  所有的试剂在实验前都要预冷。 
2.  根据大致的细胞数,或者根据离心后的细胞体积(Packed cell volume, PCV),估计试剂加入的量。PCV
因细胞类型不同而有所差异。细胞数、PCV和加入试剂的关系参见下表: 
培养皿直径  35 mm or  或 1 孔六孔板  60 mm  10 cm 
培养皿面积  10 cm2
  30 cm2
  75 cm2
 
估计细胞数量  5 ×105
  1 ×106
  5 ×106
 
估计 PCV(μl)  5  10~20  50~100 
加入 CEB-A (μl)  25  50~100  300~500 
加入 CEB-B (μl)  1.2~1.5  3~6  3~6 
加入 NEB (μl)  5~10  20  100 
 
操作步骤 
1.  裂解:(1)  培养细胞,PBS 洗涤细胞两次,估计大致的细胞数,或者估计离心后的细胞体积 PCV。每
1 ×106
个细胞加入 50~100μl 的 CEB-A,刮下细胞转移至预冷的 1.5ml 离心管;或者每体积 PCV细胞
加入 5 倍 PCV 体积的 CEB-A (即 10~20 μl PCV的细胞加 50~100μl 的 CEB-A),剧烈振荡重悬。(2) 组
织样本,称重后剪成小块,PBS 洗涤两次。通常每 10 mg 动物组织相当于 1×106
个细胞,需加入
50~100μl CEB-A,可根据组织重量按比例加入。在冰上用玻璃匀浆器或高速粉碎器破碎组织或细胞。
使用玻璃匀浆器通常需要 20~40 次上下抽动匀浆。 
2.  裂解产物转移至预冷的 1.5ml 离心管,剧烈振荡 30 秒,冰浴10~15min,期间每 5 分钟振荡 15 秒。 
3.  根据裂解物体积加入 1/20 体积的 CEB-B,振荡 10 秒,冰浴1min (加入 CEB-B 可去除核膜,适于制备
高纯度的核蛋白,但可使胞浆蛋白出现很少量的膜蛋白污染,欲制备高纯胞浆蛋白可省略此步骤)。 
4.  1000g 4 o
C 离心 5 分钟,沉淀即是核粗提物,上清则是粗制的胞浆蛋白组分。 
5.  胞浆组分制备:将上清转入另一预冷的离心管,12000g 4 o
C 离心,弃沉淀,取上清即得胞质蛋白组分,
于−20~−70ºC 保存。 
6.  核粗提物处理:取第步骤 4 的核粗提物沉淀,加入 100μl CEB-A和 5 μl CEB-B 振荡10 秒洗涤沉淀,
冰浴 1min,1000g 5min 弃上清。再次加入 100μl CEB-A和 5 μl CEB-B 重复此步骤。 
7.  核蛋白制备:在离心沉淀物(细胞核)中加入 50~100μl 预冷的 NEB (可选:使用前每 ml NEB 加入 1μL 
DTT,5μL PMSF,5μl 蛋白酶抑制剂),剧烈振荡 15 秒,冰上30min,期间每 10 min 振荡 15 秒。12000g 
5min,上清液含核蛋白成分,其中含有 25%的甘油;转入新管−20~−70ºC 保存。 
8.  只需对提取的胞质组分进行蛋白定量(Braford或 BCA法),核蛋白纯度高但含量低,无需定量。 
 
核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒(Nuclear-Cytosol Extraction Kit ) 说明:按照说明书操作,每 106
个细胞可得到 50-75μg 蛋白。试剂盒在不加入蛋白酶抑制剂时仍然工作良
好,但用户可自行加入。裂解时间是重要的,过短则细胞裂解不全导致蛋白产率低,裂解时间长则导致胞
浆蛋白有核蛋白污染。上述制备的蛋白样品与 2x SDS-PAGE 混合即可上样电泳。 
                                                                  DocRev 1006  Page 1 of 1 

会员登录

×

请输入账号

请输入密码

=

请输验证码

收藏该商铺

X
该信息已收藏!
标签:
保存成功

(空格分隔,最多3个,单个标签最多10个字符)

常用:

提示

X
您的留言已提交成功!我们将在第一时间回复您~
在线留言