大肠杆菌转化实验
时间:2015-01-21 阅读:333
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333次大肠杆菌转化可以:(1)将重组DNA分子导入大肠杆菌受体细胞进行复制,增殖和表达,以获得目的基因;(2)验证大肠杆菌感受态细胞效果;(3)用于分子生物学其他研究。
实验材料 大肠杆菌
试剂、试剂盒 CaCl2氨苄*LB
仪器、耗材 离心机分光光度计摇床
实验步骤
1. 接种—个单菌落于50 ml LB培养液中,于37℃摇床培养(250 r/min)。
2. 往一个2 L 的烧瓶中加入400 ml LB培养液,再加入4 ml 培养液,于37℃;摇床,培养至OD590为0.375。
3. 将培养液分装到8个50 ml 预冷无菌的聚丙烯管中,于冰上放置5~10 min,然后于4℃,1 600 g 离心7 min。
4. 细胞沉淀用10 ml 冰冷的CaCl2“溶液重悬,于4℃,以1 100 g 离心5 min 。
5. 细胞沉淀用10 ml 冰冷的CaCl2溶液重悬,冰上放置30 min,于4℃,1 100 g 离心5 min。
6. 用2 ml 冰冷的CaCl2溶液重悬各管细胞,然后按每管250 μl 的量分装于预冷的无菌聚丙烯管中,立即冻存于- 70℃。
7. 按照以下各步骤用10 ng pBR322转化100 μl 感受态细菌。
8. 将合适体积的转化物涂于含有氨苄*的LB平板上,37℃培养。
9. 将10 ng 加入到一个15 ml 无菌的圆底试管中,并放置冰上。
10. 将盛有感受态细胞菌的管子握在手上使菌液迅速熔化。
11. 立即将100 μl 感受态细菌加 入到管中,轻轻旋动,并放置冰上10 min 。
12. 将管故入42℃水浴2 min 进行热休克,然后加入1 ml LB 培养液于每一支试管中。
13. 于37℃置滚筒式摇床口培养1 h。
14. 将几个稀释度菌液涂布于含合适抗生素的平板上,于37℃培养12~16 h。