组织游离胆固醇测试盒（酶法）(Tissue free cholesterol )

描述：在实体组织和细胞内，胆固醇酯既是构成细胞质膜的成分，也是细胞内脂滴的主要组分。细胞内胆固醇过度聚集与动脉粥样硬化泡沫细胞形成密切相关。实体组织和细胞的胆固醇测定远比血液胆固醇测定复杂。本试剂盒避免了有毒的有机溶剂抽提、繁杂的氮气吹干和脂质复溶等步骤，采用高效能试剂裂解细胞和提取胆固醇，优化了酶学反应和操作步骤，简单易行，灵敏度高，线性范围20~5000 µmol/L。

原理：本试剂盒采用WHO、中国《全国检验操作规程》的酶学方法，结合经典GPO Trinder酶学反应^1,2，原理如下：(1) 胆固醇酯酶分解胆固醇酯为游离胆固醇。(2) 胆固醇氧化酶将游离胆固醇氧化，反应过程产生过氧化氢。(3) 在过氧化物酶催化下进行生色反应，在550nm有大吸收峰，光密度值与胆固醇浓度成正比。

参考文献

1、Trinder P. Ann. Clin. Biochem. 1969, 6: 24-27.

   2、Barham D and Trinder P. Analyst. 1972, 97: 142-145

适于测定样品：(1) 动物实体组织     (2) 培养细胞      (3) 细胞膜组分

组成 (105次微板测定或30次1 ml比色杯测定)：

(1)    裂解液 50 ml    (2)R1试剂 16 ml    (3)R2试剂 4 ml     (4)5 mmol/L胆固醇标准品0.5 ml

储存：4 ºC，储存三个月

所需设备：酶标仪、生化分析仪或721、722型可见光分光光度计。佳工作波长550nm，如无此波长建议优先选用570nm、次选530、490nm。

操作步骤；

一. 组织细胞裂解:

裂解前，组织或细胞用PBS洗涤2次去除残存血液或培养基血清，以免影响胆固醇测定。

1)      培养细胞裂解：

消化、离心收集细胞或直接在培养皿内裂解。通常6孔板单孔约2x10⁶个细胞，75cm²瓶约1x10⁷细胞。按比例每1x10^6个细胞加0.1ml裂解液，震荡混匀，静置10分钟。

2)      细胞膜成分：

每5x10⁶细胞制备的细胞膜组分，加入0.1-0.2ml裂解液（应根据预实验调整裂解液的量），震荡混匀，静置10分钟。

      3)     动物组织裂解：

切记要预先将新鲜组织剪切称重后再进行保存。组织冻存后再进行解冻、剪切、称重可能会产生严重的测量误差。离心管精确称重，加入组织块后再称重，二者相减(即减量称重法)计算组织重量(约100mg)。强烈建议按比例每1mg组织加10µl裂解液以减少样品间蛋白和脂质含量变异而产生的误差。（注意；裂解液用量在1ml或更多可保证有效的裂解与脂质提取）。用电动高速匀浆器或手动玻璃匀浆器破碎组织。（不超声方法，因其不能*和均匀破碎。应根据预实验调整初始的组织细胞加入量），而后静置10分钟。

二. 组织细胞裂解液处理

1.    取适量上清液转移到1.5ml离心管，进行步骤2的操作。余下的裂解液用BCA法蛋白定量试剂盒进行蛋白含量测定，或－20ºC储存。

2.    可选的优化步骤：70ºC加热10分钟，可能出现絮状沉淀。（此步骤即可在组织量多、胆固醇含量高时采用）。

3.    室温2000g离心5分钟，取上层清液用于酶学测定。

注意：如果得到上清的上层有较多的白色乳浊样小颗粒，重复步骤2和3。

三、工作溶液配制: 按4:1比例，取4 ml试剂R1与1 ml试剂R2混匀，立即使用或4ºC保存<1天，变色弃去。

四、标准品稀释：将5 mM胆固醇标准品用无水乙醇稀释为2500、1250、625、312.5、156、78、39µmol/L。通常稀释4个点即可。注意设置零浓度空白对照管。

五、含量测定：

1.    取190 µl工作溶液加入微板。

2.    在各工作液中，分别加入10 µl (5~10µl) 空白对照溶液（无水乙醇或蒸馏水均可）、标准品、待测样品。样品体积不可超过20µl。如测量值超过线性范围可用裂解液稀释，根据稀释倍数计算浓度。

3.    37ºC或25ºC室温反应20分钟然后进行测定。（延长反应时间可能使游离胆固醇值增加，进而使游离胆固醇的数值与总胆固醇值接近。）

4.    先用蒸馏水（或无水乙醇）+工作液的空白管调零，然后测定各管OD值。

5.    绘制标准曲线并计算浓度。

Excel作图步骤：各标准管OD值为y轴，标准品浓度为x轴。(1)鼠标左键圈住数据，点击-做图向导-，选择-散点图-，点击-完成-。(2)鼠标右键点图上的某一点，点击 -添加趋势线-，点击 -选项-，点击 -显示公式-和 -R²值-。

6.    以每mg蛋白浓度或细胞数校正胆固醇含量。

组织胆固醇酯测定：需同分别测定组织总胆固醇和游离胆固醇，二者的差值即为胆固醇酯含量，参见以下说明。

说明：

1. 维生素C>0.18g/L、血红蛋白>2g/L、还原剂二硫苏糖醇、巯基乙醇、高浓度EDTA干扰测试。

2. 不同类型的组织细胞内总胆固醇和游离胆固醇的比例差异很大。延长反应时间可能使游离胆固醇值增加因而使其值与总胆固醇值接近。由差值计算求得的胆固醇酯的值，主要适合血液样品测定，可能不很适合细胞内胆固醇酯测定。其原因主要与细胞内胆固醇酯和游离胆固醇的合成、转运、外流、储存、分解、再酯化等诸多动态生物过程的非线性的高度复杂性有关，还与现有测量方法的局限性有关。胆固醇(酯)的含量以及代谢方式在肝细胞、巨噬细胞、肌肉细胞、成纤维细胞等不同类型的细胞中存在巨大差异。有时以差值计算的胆固醇酯出现背离和偏差，甚至为负值。如果出现这种情况，建议在数据分析时采用胆固醇酯/总胆固醇比值，而非胆固醇酯绝对值；或者尝试用同位素标记方法、薄层层析、HPLC等方法测定胆固醇酯，或许会有改善。