ELISA试剂盒操作的几个关键性程序

1 标本的采取和保留 
可用作elisa测定的标本非常广泛，体液(如血清)、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液、大便)等均可作标本以测定其间某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定(如血清、尿液)，有些则需经预处理(如大便和某些分泌物)。大多数ELISA检查均以血清为标本。血浆中除尚富含纤维蛋白原和抗凝剂外，别的成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只需待血清天然凝结、血缩短后即可获得。除特殊情况外，在医学查验中均以血清作为检查标本。在ELISA中血浆和血清可同等运用。血清标本可按惯例办法收集，应留意防止溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为符号的ELISA测定中，溶血标本也许会添加非特异性显色。


血清标本宜在新鲜时检查。如有细菌污染，菌体中也许富含内源性HRP，也会发作假阳性反响。如在冰箱中保留过久，其间的可发作聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。通常说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超越一星期测定的需低温冰存。冻住血清融解后，蛋白质有些浓缩，散布不均，应充沛混匀宜轻缓，防止气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上激烈振动。混浊或有沉积的血清标本应先离心或过滤，弄清后再检查。重复冻融会使抗体效价下跌，所以测抗体的血清标本如需保留作屡次检查，宜少量分装冰存。保留血清自收集时就应留意无菌操作，也可参加恰当防腐剂。


2 试剂的预备
按试剂盒说明书的请求预备实验中需用的试剂。ELISA顶用的蒸馏水或去离子水，包含用于洗刷的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液运用pH计丈量较正。从冰箱中取出的实验用试剂应待温度与室温平衡后运用。试剂盒中本次实验不需用的有些应及时放回冰箱保留。


3 加样 
在ELISA中通常有3次加样步聚，即加标本，加酶物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，防止加在孔壁上部，并留意不行溅起，不行发作气泡。 加标本通常用微量加样器，按规则的量参加板孔中。每次加标本应更换吸嘴，避免发作穿插污染，也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定(如间接法ELISA)需用稀释的血清，可在试管中按规则的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中参加稀释液，再在其间参加血清标本，然后在微型震动器上震动1分钟以确保混和。加酶物运用液和底物运用液时可用定量多道加液器，使加液进程迅速完结。


4 保温 
在ELISA中通常有两次抗原抗体反响，即加标本和加酶物后。抗原抗体反响的完结需求有必定的温度和时刻，这一保温进程称为温育(incubation)，有人称之为孵育，在ELISA中似不恰当。 ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的只在固相表面上发作。以抗体包被的夹心法为例，参加板孔中的标本，其间的抗原并不是都有均等的和固相抗的时机，只有zui贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体触摸。这是一个逐渐平衡的进程，因而需经分散才干到达反响的结尾。在这以后参加的酶符号抗体与固相抗原的也相同如此。这即是为何ELISA反响老是需求必定时刻的温育。


温育常选用的温度有43℃、37℃、室温文4℃(冰箱温度)等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体的适宜温度。在树立ELISA办法作反响动力学研讨时，实验标明，两次抗原抗体反响通常在37℃经1-2小时，产品的生成可达。为加快反响，可进步反响的温度，有些实验在43℃进行，但不宜选用更高的温度。抗原抗体反响4℃更为*，在放射免疫测定中多使反响在冰箱中过夜，以形成zui多的沉积。但因所需时刻太长，在ELISA中通常不予选用。