线粒体复合体Ⅴ试剂盒说明书                                                                          分光光度法  25 管/12 样 
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 
测定意义 
线粒体复合体Ⅴ又称F1F0-ATP合酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，
由F1和F0两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成，也可逆过
程水解ATP。此外，复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。复合体Ⅴ是线粒体氧
化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。 
线粒体复合体Ⅴ试剂盒说明书 测定原理 
复合体Ⅴ水解ATP产生 ADP和 Pi，通过测定 Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性。 
需自备的仪器和用品 
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸
馏水。 
试剂的组成和配制 
试剂一：25mL×1瓶，-20℃保存； 
试剂二：25mL×1瓶，-20℃保存； 
试剂三：1 mL×1瓶，-20℃保存； 
试剂四：粉剂×1 支，-20℃保存；临用前每支加入 1.3mL蒸馏水，充分溶解备用，用不完的
试剂仍-20℃保存; 
试剂五：6mL×1 瓶，4℃保存； 
试剂六：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 3mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；  
试剂七：粉剂×1 瓶, 4℃保存；临用前加入 10mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；  
试剂八：粉剂×1 瓶, 4℃保存；临用前加入 10mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；  
试剂九：液体10mL×1 瓶，室温保存。 
线粒体复合体Ⅴ试剂盒说明书 定磷试剂的配制：按 H2O:  试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应
为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少） 。 
注意：配试剂用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。  
样本的前处理： 
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离： 
①   准确称取 0.1g组织或收集 500万细菌或细胞，加入 1mL试剂一和 10uL 试剂三，用冰
浴匀浆器或研钵匀浆。 
②   将匀浆 600g，4℃离心5min。 
③   弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。 
④   上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅴ（此步可选
做） 。 
⑤   步骤④中的沉淀即为线粒体，加入 800uL试剂二和 8uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，
功率 20％或200W，超声 3s，间隔 10秒，重复 30 次），用于复合体Ⅴ酶活性测定。 
 
测定步骤 
1、酶促反应 
试剂名称（μL）  对照管  测定管 
试剂四  25  25 
试剂五  100  100 
  样本      125 
混匀，  37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）准确水浴 30min 
试剂六  50  50 
样本    125   
混匀，4000g，25℃离心10min，取上清液 
2、定磷 
上清液  170  170 
定磷试剂  830  830 
混匀，室温静置 10min左右，在 660nm处读取 A测定管和 A对照管，计算 ΔA=A测定管-A
对照管。 
复合体Ⅴ活性计算 
标准条件下测定的回归方程为 y = 1.274x + 0.004；x为标准品浓度（mmol/L），y为 A值。 
1、组织中复合体Ⅴ活性的计算: 
（1）  按样本蛋白浓度计算 
单位的定义：每 mg组织蛋白每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。 
  复合体Ⅴ活性（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106
]÷(V样×Cpr) ÷T 
                                                  =62.8× (ΔA-0.004) ÷Cpr 
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。 
（2）  按样本鲜重计算 
单位的定义：每 g组织每分钟产生 1 nmol  无机磷定义为一个酶活性单位。 
  复合体Ⅴ活性（nmol/min /g 鲜重） =[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106
]÷(W× V样÷V样总) ÷T 
=50.7× (ΔA-0.004) ÷W 
（3）  按细菌或细胞密度计算 
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol  无机磷定义为一个酶活性单位。 
复合体Ⅴ活性（nmol/min  /104
  cell）=[(ΔA-0.004)  ÷1.274×V 反总×106
]÷(500×V 样÷V 样总) 
÷T=0.101× (ΔA-0.004)   
V反总：反应体系总体积，3×10-4
 L；  V样：加入样本体积，0.125 mL；V样总：加入提取
液体积，0.808 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，
g；500：细胞或细菌总数，500万。