ImmunoClone

ImmunoClone使用His-tag有下面优点：

1.标签的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能；

2.His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性；

3.His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究；

4.His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫制备抗体；

5.可应用于多种表达系统，纯化的条件温和；

6.可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。

蛋白标签都需要去除吗？

一般为了不影响目的蛋白的后续应用，都会选择一定的方式将表达时带上的各种标签去除。所以在设计构建载体时可以在标签蛋白和外源蛋白之间加上蛋白酶识别位点，这样表达纯化得到融合有标签的目的蛋白后通过蛋白酶切的方式将标签去除，得到完整的目的蛋白。这些常用的蛋白酶位点有：HRV 3C蛋白酶切位点、TEV蛋白酶切位点、肠激酶切位点、SUMO蛋白酶切位点等。但是也有几点需要说明：

1）这些酶切位点特异性都比较高，但切割效率各不相同；

2）除了SUMO蛋白酶之外，其它常用蛋白酶切除标签后都会残留几个氨基酸残基。SUMO蛋白酶识别的是SUMO标签的空间结构，然后将这个标签完整切除，不会留下多余的氨基酸残基；

3）蛋白酶的切割效率也受识别位点附近的氨基酸残基性质的影响，具体可以参见有关文献；

4）有些标签比较小，免疫原性也很弱，一般不用切除，也不会对后续研究和应用产生影响，可以不必切除。但是有些大的标签，如Dsb蛋白、FkpA蛋白、GST蛋白、SUMO标签等等，还是需要切除的。

蛋白标签是加在N端还是C端呢？

N-端或C-端标记的选择还需要根据蛋白结构、定位等特性。例如对于蛋白太小容易被降解的和比较难表达的蛋白，可以利用5’端的蛋白标签。这样既能保证蛋白的稳定性，也对外源蛋白的免疫原性影响也很小，该法适用于表位筛选。如果目的蛋白是分泌蛋白，就会遇到在目的蛋白分泌到高尔基体的过程中，蛋白5’端的信号肽，会被酶切掉的问题。这样，你标签要是装在5’端，就没什么用了。

C端His标签后未马上终止对His标签特性会不会有影响？

His分离纯化的原理为组氨*残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析（IMAC），对重组蛋白进行分离纯化，若C端His标签后未添加终止密码子，多余的氨基酸可能会影响His标签的空间构象从而影响其挂壁效果。