探针法荧光定量PCR试剂盒-上海信裕生物科技有限公司

详细介绍

探针法荧光定量PCR试剂盒它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品RNA模板。

2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。

3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4. 特异性高，引物是根据小反刍兽疫病毒高度保守区设计，不会跟其他病毒的RNA发生交叉反应。

5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR 反应。

6. 本产品只能用于科研。

规格及成分

成分	编号	十孔盒包装
探针法 qRT-PCR 缓冲液	A	500μL（黄盖）
探针法 qRT-PCR 酶混合液	B	100μL（红盖）
荧光 PCR 模板稀释液	C	1 mL（黄盖）
探针法 qRT-PCR引物混合液	D	100 μL（白盖）
小反刍兽疫病毒 qRT-PCR 探针	E	50 μL（棕色管）
探针法 qRT-PCR阳性对照(1×10E8 拷贝/μL)	F	50 μL（黄盖）
核酸释释剂（试用装）	G	20 次（1mL，绿盖）
使用手册	H	一份

运输及保存：低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

探针法荧光定量PCR试剂盒自备试剂：样品 RNA。

使用方法

一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 RT-PCR 模板稀释液，用带芯枪头，下同）。

3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 RNA 的制备

7. 如果有N个样品，设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。

8. 用自选方法纯化样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。也以选购本公司的柱式病毒RNAout。本试剂盒免费赠送20次免RNA提取的核酸释放剂试用装，该释放剂的裂解液可以直接作为RT-PCR模板，省略了RNA提取步骤。

三、Probe qRT-PCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR 管，其中N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4 个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后加）：

成分	样品管N+2个	RT-PCR阴性对照管	标准曲线样品管（2-7 管）
探针法qPCR缓冲液	各 10 μL	10 μL	各 10 μL
探针法 qPCR 酶混合液	各 2 μL	2 μL	各 2 μL
qRT-PCR探针	各 1 μL	1 μL	各 1 μL
探针qRT-PCR 引物混合液	各 2 μL	2 μL	各 2 μL
待测样品 RNA 模板	各 5 μL	--	--
超纯水	--	5 μL	--
第 7 步所得标准曲线样品稀释液（2-7 号）	--	--	各5 μL（2号样到2号管，3号样到3 号管…）

盖上盖子后上机，按下面参数进行 qRT-PCR：

过程	温度	时间
逆转录	50℃	30 min
预变性	94℃	10 min
qRT-PCR 反应（40 个循环）	94℃	15 sec
qRT-PCR 反应（40 个循环）	60℃	1 min（采集 FAM 通道的荧光信号）

五、数据处理

12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 35，则为阳性。

六、常见问题与解决方法:

常见问题	可能原因	解决方法
阳性对照、待测样本均无条带。	PCR反应体系或反应条件不合适。	使用梯度PCR摸索PCR反应条件。
	PCR试剂保存不当失去活性。	2× PCR Mix应保存于-20℃，使用时避免反复冻融。若使用频繁，可在4℃短时间存放。
	引物设计问题。	尝试重新设计引物进行检查。
阳性对照有目的条带，待测样本无条带或条带弱。	不当储存或长期储存引起试剂活性丧失。	使用新鲜的试剂。
	加入组织裂解液过量。	增大反应体系，或减少裂解液的用量。
	样本裂解混合液保存不当或保存时间过久，DNA基因组已经降解。	裂解混合液液可在4℃保存2-3天，尽量使用新制备的裂解液混合液进行PCR。
	模板加入量不适合。	在反应体系10-20%范围内优化模板加入量。反应效性能较差时，可以降模板浓度调节到低于10%的范围。
	PCR循环数不足。	适当增加PCR的循环数，推荐在35-40循环为佳。因为模板复杂，一般PCR反应要比用纯化的 DNA模板多5-10个循环为佳。
非特异性扩增	PCR退火温度太低，循环数、引物浓度或模板浓度太高。	增加PCR退火温度，降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。
	PCR引物错配。	重新设计PCR引物。
	配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。	PCR反应体系的配制在低温下进行，配制完成后尽快进行PCR扩增反应。
阴性对照出现目的条带	操作工具或试剂污染。	实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
阴性对照出现目的条带	样本间交叉污染。	每个取样器只对一个样本使用；或取完一个样本后，将取样器刃口浸入2%的次氯酸钠溶液中，反复涮洗，然后用干净的纸巾擦干残液。

产品简介

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