通用PCR试剂盒-通用RT-PCR试剂盒(M-MLV)-上海信裕生物科技有限公司

详细介绍

通用PCR试剂盒

本试剂盒适用于各种 RNA制品的反转录反应以及随后的PCR扩增。它采用M-MLV进行反转录反应，能够获得较长的反转录产物。同时，在20ul反转录体系和50ul PCR反应体系中，还可以一次性得到足够量的PCR产物用于后续的克隆实验。本试剂盒中配制的酶均为进口的酶。RT酶采用进口的M-MLV，所以cDNA更长，基因的信息保留得更完整！反转录过程中特异的RNase抑制剂可有效降低由于外源RNase污染而导致实验失败的风险。本试剂盒使用方便、快捷，可广泛用于cDNA克隆及目的基因检测等分子生物学实验。

通用RT-PCR试剂盒(M-MLV)产品简介

莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶（M-MLV RT）是一种RNA依赖的DNA聚合酶，能使mRNA（>5kb）转录为cDNA。M-MLV RT的RNase H活性相对于禽成髓细胞瘤病毒反转录酶较弱，更适合用来反转录较长的mRNA。M-MLV RT应用于以RNA为模板合成cDNA的一条链。

注意：M-MLV RT的延伸性要低于AMV 反转录酶，因此要得到和用AMV 反转录酶一样产量的cDNA需加入更多单位的M-MLV反转录酶。

通用RT-PCR试剂盒使用方法

1）使用方法简介以用2mg总RNA为例。在无RNase离心管中，加入0.5mg引物至含总RNA的样品中，总体积不大于15ml。70℃，5分钟打开模板链形成的二级结构。立即放于冰上降温防止二级结构恢复，随后短暂离心使液体集中在离心管底。

2）加入以下成分到已退火后的引物-模板混合物中。

注意：不要改变引物的加入比率。

通用PCR试剂盒常见问题与解决方法:

常见问题	可能原因	解决方法
阳性对照、待测样本均无条带。	PCR反应体系或反应条件不合适。	使用梯度PCR摸索PCR反应条件。
	PCR试剂保存不当失去活性。	2× PCR Mix应保存于-20℃，使用时避免反复冻融。若使用频繁，可在4℃短时间存放。
	引物设计问题。	尝试重新设计引物进行检查。
阳性对照有目的条带，待测样本无条带或条带弱。	不当储存或长期储存引起试剂活性丧失。	使用新鲜的试剂。
	加入组织裂解液过量。	增大反应体系，或减少裂解液的用量。
	样本裂解混合液保存不当或保存时间过久，DNA基因组已经降解。	裂解混合液液可在4℃保存2-3天，尽量使用新制备的裂解液混合液进行PCR。
	模板加入量不适合。	在反应体系10-20%范围内优化模板加入量。反应效性能较差时，可以降模板浓度调节到低于10%的范围。
	PCR循环数不足。	适当增加PCR的循环数，推荐在35-40循环为佳。因为模板复杂，一般PCR反应要比用纯化的 DNA模板多5-10个循环为佳。
非特异性扩增	PCR退火温度太低，循环数、引物浓度或模板浓度太高。	增加PCR退火温度，降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。
	PCR引物错配。	重新设计PCR引物。
	配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。	PCR反应体系的配制在低温下进行，配制完成后尽快进行PCR扩增反应。
阴性对照出现目的条带	操作工具或试剂污染。	实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
阴性对照出现目的条带	样本间交叉污染。	每个取样器只对一个样本使用；或取完一个样本后，将取样器刃口浸入2%的次氯酸钠溶液中，反复涮洗，然后用干净的纸巾擦干残液。