发表过国外文献人神经型一氧化氮合成酶(nNOS)ELISA试剂盒*

检测范围 0.156 IUml-10 IUml 
灵敏度 0.039 IUml

人神经型一氧化氮合成酶(nNOS)ELISA试剂盒特异性：本试剂盒可同时检测天然或重组的，且与其他相关蛋白无交叉反应。

有效期：6个月

人神经型一氧化氮合成酶(nNOS)ELISA试剂盒预期应用：ELISA法定量测定血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中的含量。

说明

1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。

2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。

3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。

4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。

人神经型一氧化氮合成酶(nNOS)ELISA试剂盒实验原理

用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗该指标抗体的微孔中依次加入标本或标准品、*化的抗该指标抗体、HRP标记的亲和素，经过*洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的该指标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人神经型一氧化氮合成酶(nNOS)ELISA试剂盒试剂盒组成及试剂配制

1.         酶联板（Assay plate ）：一块（96孔）。

2.         标准品（Standard）：2瓶（冻干品）。

3.         样品稀释液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。

4.         *标记抗体稀释液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。

5.         辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。

6.         *标记抗体（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）

7.         辣根过氧化物酶标记亲和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100）

8.         底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。

9.         浓洗涤液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。

10.     终止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

需要而未提供的试剂和器材

1.         标准规格酶标仪

2.         高速离心机

3.         电热恒温培养箱

4.         干净的试管和Eppendof管

5.         系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，用多通道移液器

6.    蒸馏水，容量瓶等

标本的采集及保存

1.         血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过一晚后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.         血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.         细胞培养物上清或其它生物标本：1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

注：标本溶血会影响zui后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

人神经型一氧化氮合成酶(nNOS)ELISA试剂盒标本的稀释原则：

首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中，应做好详细的记录。zui后计算浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。

标准品的稀释原则：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为300 pg/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释300 pg/ml，150 pg/ml，75 pg/ml，37.5 pg/ml，18.5 pg/ml，9 pg/ml，4.5 pg/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0 pg/ml，临用前15分钟内配制。

如配制150 pg/ml标准品：取0.5ml（不要少于0.5ml）300 pg/ml的上述标准品加入含0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。

*标记抗体的稀释原则：

临用前以*标记抗体稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100μl），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl*标记抗体加990μl*标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则：

临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100μl），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根过氧化物酶标记亲和素加990μl辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

操作步骤

实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。

1.         加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。

为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.         弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加*标记抗体工作液 100μl（取1μl*标记抗体加99μl*标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。

3.         温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。

4.         每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同*标记抗体工作液） 100μl，37℃，60分钟。

5.         温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。

6.         依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.         依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.         用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。 在加终止液后15分钟以内进行检测。

注：

1. 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。

2. 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是zui后加底物溶液及2N H₂SO4。测量时先用此孔调OD值至零。

3. 为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。

4. 未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。标准品、*标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、*标记抗体工作液或、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。

5. 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。