口蹄疫病毒RT-PCR检测试剂盒.
时间：2012-02-01 阅读：5259
口蹄疫病毒 RT-PCR检测试剂盒使用说明书
用途
口蹄疫病毒( FMDV)反转录聚合酶链反应( RT-PCR)，用于检测疑似感染动物的水疱皮或水疱液中所有血清型的 FMDV，适用于 FMDV的检测、诊断和流行病学调查。
原理
利用离心柱内硅基质膜提取 RNA，在反转录酶的作用下，以 RNA为模板，以引物为起点合成与 RNA模板互补的 cDNA链。在 TaqDNA聚合酶的作用下，经高温变性、低温退火、中温延伸的循环，使特异 DNA片段的拷贝数放大一倍。经过 35次循环，zui终使扩增 DNA片段放大了数百万倍。将扩增 DNA片段进行电泳，经染色后，在紫外灯照射下，肉眼可见到 DNA片段的扩增带。
试剂
1．试剂盒组成
2．试剂盒保存期：6个月。
需要自备的器材
1．仪器：分析天平、离心机、 PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪(或紫外分析仪)、微波炉、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器(2µL、20µL、200 µL、1000 µL)。
2．耗材：眼科剪、眼科镊、称量纸、 20mL一次性注射器、生理盐水、琼脂糖、 500mL量筒、500 mL锥形瓶、经焦碳酸二乙酯( DEPC)水处理的灭菌 1.5mL离心管和吸头( 10 µL、200µL、1000 µL)、灭菌双蒸水。
使用注意事项
1．所有接触病料的物品均应合理处理，以免污染实验室。 2．PCR整个试验分配液区、模板提取区、扩增区、电泳区。流程顺序为配液区
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模板提取区扩增区
电泳区。严禁器材和试剂倒流。
1 所有试剂应在规定的温度储存， -20℃保存的各试剂使用前应放于室温*融化，使用后立即放回 -20℃。
2 染色液低毒，应于室温条件避光保存，操作时应戴上手套。
3 注意防止试剂盒组分受污染。使用前将红盖管 8000 rpm离心 15 s，使液体全部沉于管底，放于
冰盒中，吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取。
1 不要使用超过有效期限的试剂，试剂盒之间的成分不要混用。
2 RNA提取过程中，避免 RNA酶污染，尽量缩短操作时间。
3 严格遵守操作说明可以获得的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须。
4 反复冻融试剂将减低检测灵敏度，建议在 3次内用完，请严格按试剂盒说明书操作。
样品制备
1样品采集：病死或扑杀的偶蹄动物，取溃烂或溃疡的表皮组织等；待检的活动物，取水疱皮或水疱液置于 50%甘油生理盐水中。2～8℃保存，送实验室检测。(要求送检病料新鲜，严禁反复冻融。) 2样品处理：每份样品分别处理。
1. 1组织样品处理：每份组织分别从三个不同的位置称取样品约 1g，用手术剪剪碎混匀后取 0.05 g于研磨器中研磨，加入 1.5 mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至 1.5 mL灭菌离心管中，8000rpm离心 2min，取上清液 100 µL于 1.5 mL灭菌离心管中。
2. 2水疱液处理：取 100 µL，置 1.5 mL灭菌离心管中。
3. 3阳性对照处理：取阳性对照 100µL，置 1.5mL灭菌离心管中。
4. 4阴性对照处理：取阴性对照 100µL，置 1.5mL灭菌离心管中。
操作步骤 1病毒 RNA的提取
1.1取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液 600µL，充分颠倒混匀，室温静置 3～ 5min。
1.2将液体吸入吸附柱中(吸附柱要套上收集管，吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质，以免离心时堵塞吸附柱)，13000rpm离心 30s，弃去收集管中液体，套上收集管。
1.3向吸附柱中加入 600 µL洗液，13000 rpm离心 30 s，弃去收集管中液体，套上收集管。
1.4重复步骤 1.3。
1.5再空柱 13000rpm离心 2min。
1.6将吸附柱移入新的 1.5 mL离心管中，在膜中央加入洗脱液 25 µL，室温静置 1min，13000rpm离心 30 s，获得总 RNA。 2RT-PCR操作程序
每份总体积 20 µL，含 16.8µLRT-PCR反应液(用前混匀)，1.2 µL酶混合液，2µL模板 RNA。
例如：n份样品(n<10)，配制 n+1份，16.8×(n+1)RT-PCR反应液，再加入 1.2×(n+1)酶混合液混匀，取 18µL分装成 n份，分别加入 2µL模板 RNA(阳性对照管加入 1µL阳性对照 RNA和 1µLX液)，加入矿物油 20 µL覆盖(有热盖的 PCR扩增仪不用加矿物油)，作好标记。
在 PCR扩增仪上进行以下程序： 42 ℃ 45 min，95 ℃ 3min；扩增条件为 95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s， 35个循环； 60℃延伸 3min。 3电泳
称 4g琼脂糖放于 500mL锥形瓶中，加入 50倍稀释的 TAE电泳缓冲液 200mL(取 4mL50倍 TAE电泳缓冲液，用双蒸水稀释至 200 mL)，于微波炉中熔解，再加入 10 µL染色液混匀。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将 PCR扩增产物 10 µL混合 2µL上样缓冲液，点样于琼脂糖凝胶孔中，以 110～120V电压于 50倍稀释的 TAE电泳缓冲液中电泳，紫外灯下观察结果。
结果判定
阳性对照出现 131 bp扩增带、阴性对照无带出现(引物带除外)时，实验结果成立。被检样品出现 131 bp扩增带为口蹄疫病毒阳性，否则为阴性。
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