1．特异性染色效价测定

    直接染色效价以倍比稀释荧光抗体溶液，如1：2、1：4、1：8…，与相应抗原标本作一系列染色，荧光强度在“+++”的zui大稀释度为其染色滴度（效价）或单位。实际染色应用时，可取低1个或2个稀释度（即2～4个单位），如染色效价为1：64，实际应用时可取1：32或1：16。间接染色效价可按间接免疫荧光组化染色步骤，先用特异性一抗与组织中抗原结合，再用不同稀释度的荧光抗体染色，结果以荧光强度“+”至“+++”为标准，染色用效价和直接法相同。

 

    2．非特异性染色测定

    根据荧光抗体的用途不同，可用相类似的抗原切片或涂片，倍比稀释荧光抗体，按常规染色，在标本上出现的非特异染色应显著低于特异性染色滴度，否则应采取消除非特异性染色的方法处理荧光抗体。

 

    3．吸收试验

    在荧光抗体中加入过量相应抗原，于室温中搅拌2h后移人4~C中过夜，3000r／min离心30min：收集上清液，再用相应抗原阳性标本染色，结果应不出现明显阳性荧光。

 

    F（荧光素）和P（抗体蛋白）的摩尔比值反映荧光抗体的特异性染色质量，一般要求F／P的摩尔比值为1～2。过高时，非特异性染色增强；过低时，荧光很弱，敏感性低。F／P比值可按下述方法进行测定。

 

    ①蛋白质定量  测定荧光抗体的蛋白质浓度（mg／m1）。

 

    ②结合荧光素定量  先制作荧光素定量标准曲线，即准确称取FITC lmg，溶于10ml小5mol／L（pH9．0）碳酸盐缓冲液中，再用0．01mol／L（pH7．2）PBS稀释到100ml，此时荧光素含量为long／m1，以此为原液。再倍比稀释9个不同浓度的溶液，用分光光度计在490nm波长测定光密度值（OD），以光密度为纵坐标，荧光素含量为横坐标，作标准函数图。荧光素与蛋白质结合后，其吸收光谱峰值向长波方向位移约5nm，FITC和蛋白质结合舌吸收光谱峰值由490nm变为493—495nm，RB200和蛋白质结合后吸收光谱峰值变为595nm。

 

    ③F／P比值的计算  可按以下公式计算。

式中，1．6X108为抗体蛋白质的相对分子质量；390为FITC的相对分子质量；蛋白质从（g）换算为毫克（mg）需乘以103；而荧光素从克（g）换算为微克（Pg）需要再乘以106。