用于噬菌体cDNA文库展示的载体
时间：2011-01-25 阅读：321
互补DNA（cDNA）克隆基因的表达是基因分离与鉴定的一个极为有效的工具。用于筛选的核苷酸探针需要所感兴趣基因的原始序列信息，而对于表达cDNA文库的筛选只需要一个天然的配体或一个特异的抗体（单克隆或多克隆）作为探针。体外筛选入噬菌体或质粒展示的cDNA文库要将翻译产物黏附在膜上，这样优于用标记探针来筛选，但这种转移能使cDNA编码的蛋白变性且危及到检测的准确性。而酵母双杂交系统*在体内操作，重组了一个转录激活因子并通过报告基因的表达来检测蛋白与蛋白之间的相互作用。总的来说，这些系统难以承担大容量文库的筛选任务，于是促进了基于选择而不是筛选的多个系统的发展。由于敏感性和选择性，通过反复富集和特异性相互作用的选择要比筛选的要求更小。然而，选择已表达的克隆，在此基础上进行cDNA克隆只需要每个cDNA（为了扩增）和它的基因产物（为了检测）之间有物理链接。为cDNA克隆基因表达设计的*批选择系统中有一个系统发展为用于分离表达特异细胞受体的哺乳动物转化株。zui近以来，作为从大容量文库（≥108克隆）中选择特异的结合肽或蛋白的强大工具，噬菌体展示技术的到来为cDNA克隆基因表达提供了发展的机会。
1 丝状噬菌体
因为全长cDNA包括在3’末端的翻译终止子，原核表达时缺乏合适的核糖体结合位点（如果这些cDNA来源于真核细胞），确保cDNA在噬菌体表达的zui实际的方法是将5’末端与载体基因融合。传统上，噬菌体展示是与衣壳蛋白pⅢ或pⅧ的N末端融合，并且普遍认为直接与任一个衣壳蛋白的C末端融合都与噬菌体装配不相容。因此，围绕这些限制条件设计了三个专门的载体：一个策略是把pⅢ与c-Jun的*拉链融合，而翻译的cDNA产物与c-Fos（pJufo）的*拉链的C末端融合。噬菌体装配时，拉链结合在噬菌体的末梢，因此壳体包裹的eDNA与它编码的产物相连。第二个策略是直接相互获取法（Direct Interaction Rescue），利用小衣壳蛋白pⅢ的功能模块性：eDNA通过与pⅢ的感染性结构域的C末端融合来表达，而蛋白探针放在pⅢ的C末端部分，包埋在噬菌体的核心。只有那些能在探针和特异的eDNA编码产物之间建立稳定相互作用的噬菌体才能恢复它们的感染性，同时用来在大肠杆菌中扩增。第三个策略（在本章将详细描述）是围绕pⅢ并基于一个结论，这个结论是小衣壳蛋白pⅥ的C末端表达在表面，因此一个富含*的六肽基因Ⅵ（gⅥ）-cDNA的融合基因可以在噬菌体表面显示。蛋白Ⅵ（pⅥ）通过在pⅢ和噬菌体核心之间提供链接来稳定噬菌体的结构。这三个系统在蛋白配体和（或）多克隆抗血清选择文库中的eDNA克隆相互作用上被证明是成功的。zui近一团体出人意料地报道了通过优化联接序列（8～10个氨基酸）与pⅢ或pⅧ的C末端融合，多肽能在丝状噬菌体表面被功能性地展示出来。理论上，这个惊人的功能融合应该在eDNA克隆基因表达上起着很重要的作用，但是理论上的证据仍然需要证明。
2 溶解性噬菌体（lytic bacteriophage）
在丝状噬菌体系统中，衣壳蛋白先组合成噬菌体颗粒，然后定位在外周胞质上。然而这种途径适应于有二硫键形成的蛋白（例如分泌蛋白或受体的细胞外结构域），但它与在还原环境下能正常折叠的eDNA编码产物不相容。事实上，大多数噬菌体颗粒内部结构相似，如入噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体，它们都用来展示编码细胞内部蛋白的cDNA。在入噬菌体中，已经报道了与衣壳蛋白DEl5]或尾部蛋白VD6]的C末端融合。衣壳蛋白D用来显示和选择cDNA片段，这些片段来源于丙型肝炎病毒基因组、人脑以及小鼠的胚胎。在T4噬菌体中，衣壳蛋白WAC和SOC的C末端作为蛋白的靶点，用于共价展示，而T7噬菌体展示系统依赖于衣壳蛋白10A的C末端的溶解性。近年来，在多个报道中都证明了以eDNA选择为目的的系统具有可用性。利用这个具有前景的方法制备一个克隆试剂盒在商业上是可行的（Novagen）。