凝集反应是指细菌、红细胞等颗粒性抗原或表面覆盖抗原的颗粒状物质与相应抗体特异结合，在适量电解质存在的条件下，形成肉眼可见的凝集现象。

一、直接凝集反应

颗粒性抗原(如细菌、红细胞等)直接与相应特异性抗体结合，在适量电解质存在条件下，出现肉眼可见的凝集现象，称直接凝集反应。参加的抗原称为凝集原，而抗体则称为凝集素。直接有玻片法和试管法两类。

(一)玻片

在玻片上进行的直接,主要用于抗原的定性分析,数分钟之内便可观察结果,快速、简便。常用于细菌的分型鉴定,也用于ABO血型的测定。

【 实验材料 】

( 1)抗原：受检菌液或受检者的血细胞盐水悬液。

( 2)抗体：用于细菌鉴定的1：20稀释诊断血清。

血型检测的A及B诊断血清。

( 3)生理盐水、玻片、吸管、接种环。

【 实验方法 】

( 1)于洁净玻片的一端加诊断血清1滴，另一端加生理盐水1滴作阴性对照。

( 2)用接种环取待检菌液或血细胞悬液分别涂于诊断血清和生理盐水，混匀。

( 3)轻摇玻片，静置数分钟，观察结果。

【 结果分析 】

玻片上抗原凝集成肉眼可见的小团块状或絮状凝集物，其周围液体澄清，为阳性反应。阴性反应和生理盐水对照均不发生凝集，为均匀混浊的乳状液。

【 注意事项 】

细菌鉴定时，特别是肠道菌种的沙门菌属或志贺菌属，原则上先用多价诊断血清检测，如为阳性，再用单价诊断血清进行分群或定型。血型测定时，室温需保持在 20oC左右，若低于10oC，易出现冷凝集现象而造成假阳性的错误诊断。

(二)试管

是用定量的颗粒性抗原悬液与一系列倍比稀释的待检血清在试管中进行的，根据试验结果判定待检血清中有无相应抗体及其效价，对血清中抗体进行半定量分析。此法目前仍常用于某些病原微生物感染的免疫学诊断，例如，诊断伤寒和副伤寒的肥达氏( Widal test)反应，诊断斑疹伤寒的外—裴氏反应(weil-felix test)。

【 实验材料 】

诊断菌液, 1:10稀释的待检血清，生理盐水，小试管，刻度吸管，试管架，恒温水浴箱。

【 实验方法 】

(1)稀释待检血清取8支试管排列于试管架上,依次编号,每管加入0.5ml生理盐水。于第1管中加入0.5ml待检血清,充分混匀后,吸出0.5ml加入第2管,同法混匀后又吸出0.5ml加入第3管,依次类推,连续稀释至第7管,zui后从第7管中吸出0.5ml弃去。第8管为生理盐水对照管。

(2)于各管中加入诊断菌液0.5ml,振摇试管架，充分混匀。

(3)将试管静置于37oC恒温水浴箱中40min。

【 结果分析 】

( 1)首先观察阴性对照管，应无凝集现象，管底沉积呈圆形，边缘整齐，轻轻摇动则沉积菌分散均匀呈混浊现象。

•  观察实验管，凝集现象可根据强弱程度，分为五级：

++++ 细菌全部凝集，管底形成大片凝集物。

+++ 细菌大部分凝集，管底的片状凝集物较小而薄。

++ 约半数的细菌发生凝集，管底出现凝集环。

+ 仅有少部分细菌凝集，管底可见沉积的细菌周边有稀疏、点状的凝集物。

— 液体混浊，无凝集。

( 3)血清抗体效价的判定：以出现明显凝集现象(++)的血清zui高稀释度作为受检血清的抗体效价。

【 注意事项 】

实验中应注意反应体系的温度、电解质浓度及酸碱度( pH值)。

二、间接

将可溶性抗原(或抗体)先吸附在一种与免疫无关，一定大小的载体颗粒表面成为致敏载体颗粒，然后与相应抗体(或抗原)结合，在适量电解质存在的条件下，出现肉眼可见的特异性凝集现象，称间接，此法敏感度比直接高，因而广泛地应用于临床检测中，间接中常用的载体颗粒有人 “ O”型红细胞、动物红细胞、活性炭或硅酸铝颗粒，聚苯乙烯乳胶微球等。

(一)正向间接血凝试验

将绵羊红细胞或人的“ O”型红细胞用醛类固定(称为醛化，可改变血球表面性质，使其易于吸附蛋白质类抗原，并可长期保存使用)，再将可溶性抗原吸附于醛化的血细胞上，制成抗原致敏的红细胞，当与相应的抗体结合，使红细胞被动的聚合在一起，出现肉眼可见的凝集现象，常用于检测传染病抗体或自身抗体。

【 实验材料 】

( 1)抗原制备：将伤寒杆菌接种在培养基上，37oC培养24小时，用生理盐水洗下，100oC水浴2小时，离心弃上清，稀释后备用。

( 2)致敏红细胞的制备：取稀释的抗原与等体积的已醛化的2%SRBC混合，37oC水浴2小时，每隔15分钟振摇一次，取出后洗涤弃上清，稀释成0.5%备用。

( 3)试管、试管架、刻度吸管、恒温水浴箱。

【 实验方法 】

( 1)取8支小试管排列于试管架上，依次编号。每管加入0.25ml生理盐水。于第1管内加入1:10稀释的免疫血清0.25ml混匀，倍比稀释至第7管。第8管为阴性对照。

( 2)每管中加入0.25ml致敏绵羊红细胞，振摇试管架，使之充分混匀。

( 3)将试管架静置于37oC恒温水浴箱中1小时。

【 结果分析 】

( 1)首先观察阴性对照管，应无凝集现象，管底红细胞沉积呈圆形，边缘整齐，轻轻摇动则沉积菌分散均匀呈混浊现象。

( 2)观察实验管，凝集现象可根据强弱程度，分为五级：

++++ 细菌全部凝集，管底形成大片凝集物。

+++ 细菌大部分凝集，管底的片状凝集物较小而薄。

++ 约半数的细菌发生凝集，管底出现凝集环。

+ 仅有少部分细菌凝集，管底可见沉积的细菌周边有稀疏、点状的凝集物。

— 液体混浊，无凝集。

( 3)血清抗体效价的判定：以出现明显凝集现象(++)的血清zui高稀释度作为受检血清的抗体效价。

【 注意事项 】

•  红细胞需来自同一个体、批号相同，且致敏血球应新鲜配置。

•  使用器材必须清洁，否则对结果有很大影响。

(二)反向间接血凝试验

将特异性抗体吸附于醛化的红细胞上，再与相应抗原结合，在适量电解质存在条件下，红细胞被动聚集出现肉眼可见凝集现象。用于检测标本中的相应可溶性抗原。

【 实验材料 】

( 1)1:20抗—HBs致敏的醛化血球、纯化的1:20抗—HBs、待检血清、稀释液。

( 2)“V”型微量血凝板，0.025ml稀释棒、微量搅拌器、刻度吸管、滴管(40滴/ml)。

【 实验方法 】

( 1)配制致敏血球悬液 于每瓶冻干诊断血球加4ml稀释液，轻轻旋摇使成均匀血球悬液，浓度约为0.6%。

( 2)正式试验

① 在“V”型微量血凝板上，每份待检血清设立8孔，于各孔内用40滴/ml滴管各加1滴稀释液(相当于0.025ml)。

② 用0.025ml容量的稀释棒蘸满待检查血清分别依次在各孔内捻转作倍比稀释(一般每孔内均需捻转10次左右)，直至第7孔，第8孔为致敏血球对照。另设第9孔为阳性对照，加0.025mlHBsAg阳性血清。

③ 于每孔中加0.025ml混匀的致敏血球悬液。

④ 将血凝板置于微型振荡器上振荡1~2分钟，置37oC1小时后观察结果。

反向间接血凝试验操作程序

【 结果分析 】

不凝集：红细胞全部下沉，集中于孔底，形成致密的圆点。

明显凝集(++)：红细胞于孔底形成薄膜状凝集，*可见疏松的红点。

出现明显凝集的血清zui高稀释度为 HBsAg效价，凡效价≥1:16者需进一步做中和试验。

中和试验

在血凝板上每份标本设测定排与对照排，每排 8孔。于每孔加稀释液0.025ml，用2支稀释棒蘸取被检血清，分别在2排作倍比稀释到第7孔，第8孔不含血清，为血球对照，然后，于测定排各孔加稀释液0.025ml，对照排各孔加1:20抗HBsAg0.025ml，血凝板振荡1~2分钟，置37oC30分钟。取出，于各孔加0.025ml致敏血球，振摇混匀，置37oC1小时后观察结果。

凡正式试验效价≥ 1:16，且中和试验的对照排凝集孔数至少低于测定排凝集孔数2孔者，为HBsAg阳性，否则系非特异性凝集。

【 注意事项 】

( 1)配制的致敏血球悬液一般当天用完，若置2~10oC，使用期不超过3天。

( 2)试验用的血凝板、滴管、稀释棒等器材必须十分清洁，否则易造成非特异性凝集。

•  血凝板、稀释棒用后均需用次氯酸钠( 10%v/v)浸泡过夜；滴管需煮沸10分钟，然后用水冲净，再用蒸馏水冲洗，晾干备用。