DNA重组技术的操作步骤

一个典型的DNA重组包括五个步骤： 　　（1）目的基因的获取 　　目前，获取目的基因的方法主要有三种：反向转录法、从细胞基因组直接分离法和人工合成法。 　　反向转录法是利用mRNA反转录获得目的基因的方法。从细胞基因组中直接分离目的基因常用"鸟枪法"，因为这种方法犹如用散弹打鸟,所以又称"散弹枪法"。用"鸟枪法"分离目的基因，具有简单、方便和经济等优点。许多病毒和原核生物、一些真核生物的基因，都用这种方法获得了成功的分离。 化学合成目的基因是20世纪70年代以来发展起来的一项新技术。应用化学合成法，可在短时间内合成目的基因。科学家们已相继合成了人的生长激素释放抑制素、胰岛素、干扰素等蛋白质的编码基因。 （2）DNA分子的体外重组 　　体外重组是把载体与目的基因进行连接。例如，以质粒作为载体时，首先要选择出合适的限制性内切酶，对目的基因和载体进行切割，再以DNA连接酶使切口两端的脱氧核苷酸连接，于是目的基因被镶嵌进质粒DNA，重组形成了一个新的环状DNA分子（杂种DNA分子）。 （3）DNA重组体的导入 把目的基因装在载体上后，就需要把它引入到受体细胞中。导入的方式有多种，主要包括转化、转导、显微注射、微粒轰击和电击穿孔等方式。转化和转导主要适用于细菌一类的原核生物细胞和酵母这样的低等真核生物细胞，其他方式主要应用于高等动植物的细胞。 （4）受体细胞的筛选 由于DNA重组体的转化成功率不是太高，因而，需要在众多的细胞中把成功转入DNA重组体的细胞挑选出来。应事先找到特定的标志，证明导入是否成功。（5）基因表达 目的基因在成功导入受体细胞后，它所携带的遗传信息必须要通过合成新的蛋白质才能表现出来，从而改变受体细胞的遗传性状。目的基因在受体细胞中要表达，需要满足一些条件。例如，目的基因是利用受体细胞的核糖体来合成蛋白质，因此目的基因上必须含有能启动受体细胞核糖体工作的功能片段。