炭疽芽孢杆菌A16R株       

       为研究炭疽芽孢杆菌A16R株中的同源整合频率和机制，采用不能在链霉菌中复制的大肠杆菌质粒转化链霉菌Streptomyces lincolnensis B48。质粒pYYE04al上携带的被硫链丝菌素抗性基因灭活的林可霉素生物合成基因与染色体DNA上的同源基因发生重组，经过低抗筛选，得到两个突变子S.lincolnensis YY1和S.lincolnensis YY2。进一步以硫链丝菌素抗性基因为探针杂交染色体DNA smaⅠ片段，S.lincolnensis YY1和S.lincolnensis YY2都得到1.5kb的阳性条带；而以缺失的lacZ基因为探针杂交染色体DNA成HindⅢ和SmaⅠ联合酶切片段，只有S.lincolnensis YY2得到4.4kb的阳性条带。Suthern杂交结果表明S.lincolnensis YY1是由同源交换或二次重组产生的，而S.lincolnensis YY2为同源整合的结果。为验证同源整合子上大肠杆菌复制子和氨苄抗性基因的存在，用Sph Ⅰ酶切染色体DNA后连接，连接液转化E.coli JM83感受态细胞，在氨苄抗性板上得到2个转化子，命名为pSLE1。对其进行酶切鉴定的结果表明它是转化质粒pYYE04al的一部分。

       构建炭疽芽孢杆菌A16R株eag基因缺失突变株，为研究eag基因的功能奠定了基础。[方法]本研究以我国人用炭疽杆菌活疫苗A16R株中eag基因为目的缺失基因，根据炭疽芽孢杆菌Ames株基因组序列，利用软件设计了扩增上下游同源臂以及抗性基因引物，构建了重组质粒，将该重组质粒电击转入炭疽杆菌A16R感受态细胞中，利用同源重组原理筛选到炭疽杆菌A16R株eag基因缺失突变株。在分子水平及蛋白质组学方面对基因缺失突变株进行验证。[结果]成功构建了重组质粒，经同源重组后获得eag基因缺失突变株。PCR鉴定表明目的基因已经丢失；SDS PAGE表明野生株与突变株在93 kDa处有差异蛋白条带，经质谱鉴定分析该条带为目的基因所表达的EA1蛋白；双向电泳结果显示突变株与野生株比较明显缺失3个蛋白点，经质谱分析后确定这3个点都是EA1蛋白。[结论]成功获得eag基因缺失突变株，为深入研究eag基因的功能奠定了基础，同时也为炭疽芽孢杆菌重要基因功能的研究建立了一个良好的技术平台。