3月13日，《德国应用化学》杂志在线发表了*生物物理研究所王江云课题组和美国伊利诺伊大学香槟分校（University of Illinois at Urbana-Champaign）化学系陆艺教授课题组的合作研究成果：Dramatic Increase of Oxidase Activity through the Genetic Incorporation of Tyrosine-Histidine Crosslink in a Myoglobin Model of Heme-Copper Oxidase（Angew. Chem. Intl. Ed. DOI: 10.1002/anie.201108756）。该研究利用非天然氨基酸的定点插入，实现了用18kD 的肌红蛋白模拟呼吸链中重要膜蛋白复合物*氧化酶。该工作提供了*氧化酶中保守翻译后修饰Tyr-His功能的直接证据，是蛋白质设计领域的重要进展，并有望在生物能学中获得重要应用。

*氧化酶（CcO）即呼吸链复合体IV是线粒体氧化呼吸的限速酶，它直接参与线粒体中氧气的还原和质子梯度产生，它的损伤影响线粒体功能，导致大量产生活性氧。由于CcO在能量产生和调节中的重要地位，自被发现以来一直是生物研究领域中重要的研究课题。X-射线晶体结构衍射研究发现，哺乳动物或细菌中都含有经翻译后修饰形成的Tyr-His 共价交联，但因受技术手段的限制及缺乏直接的证据，对于共价交联Tyr-His的确切作用目前仍是科学研究争议的焦点。

通过人工进化的方法可以增加非天然氨基酸的新基因编码。研究人员首先把无意密码子“UAG”确定为新的遗传密码，然后对天然的组装核糖核酸（tRNA）突变，使其含有反密码子“CUA”。在此基础上，从氨酰-tRNA合成酶突变库中筛选出可专一结合这种tRNA和非天然氨基酸的氨酰-tRNA合成酶突变体。之后，将生命体中mRNA上任意一个遗传密码取代为UAG，并在培养基中加入化学合成的非天然氨基酸，就可以在蛋白质中相应的位置插入有特殊物理性质、化学性质的非天然氨基酸。

本研究首先筛选得到了对含有Tyr-His共价交联特征元素的3-咪唑基*特异性识别的氨酰-tRNA合成酶，并将该非天然氨基酸插入到了模型蛋白Myoglobin中。再将Mb活性中心空穴内的氨基酸Leu29突变成His，Phe33突变为3-咪唑基*，实现了催化还原氧气转化为水分子，产生小于6%的活性氧，催化转化数超过1000，催化剂未出现明显降解。

作为对照，研究人员构建了突变体Leu29His/Phe33Tyr/Phe43His （F33YCuBMb），其中，29位、43位和64位His可以形成一个铜离子结合位点，而33Tyr和43His在Mb上的位点及结构与imiTyrCuBMb中33位imiTyr的咪唑基团及酚基团类似，但没有形成共价交联。相比imiTyrCuBMb，F33YCuBMb将50%的O2转化成了ROS。这一研究结果表明了Tyr-His翻译后修饰共价交联的重要性。在此基础上，研究人员将能进一步利用非天然氨基酸定点插入及定向进化提高*氧化酶模型蛋白的活性，并将其应用到生物电极中。