ELISA实验操作中常见问题--试剂的影响：

    ELISA 诊断试剂经历了从合成肽向基因工程抗原的过渡。由于历史的原因，人们往往以反应本底的好坏来衡量ELISA 反应 试剂盒，因此有些厂家为了保持较好的本底采用了单片段基因工程抗原及合成肽包被，该类 试剂盒的流行病学敏感度不够，稳定性也成问题。也有厂家坚持 试剂盒高的流行病学敏感度，科学地对待反应结果。基因工程抗原较合成肽抗原有*的*性，就HCV-ELISA 试剂盒来讲，*代产品为合成肽抗原，主要是HCV 特异性抗原决定簇的肽片段；第二代产品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是当时的基因工程抗原不全，仅包括了HCV 的核心区片段；第三代产品基本上采用了基因工程抗原，而且这些抗原包括更多、更稳定、纯度更高的HCV 特异性抗原。第三代 试剂的敏感度大大提高了。基因工程抗原与合成肽抗原的区别如下：

    基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或 酵母菌为表达系统。该类抗原与合成肽相比具有以下特点：

a.分子量大。合成肽采用化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个氨基酸；而利用基因工程制备的抗原，分子量更大。

b.稳定性好。包被的抗原的稳定性可使 试剂盒的效期得到保证，早期以合成肽为包被抗原的 试剂盒效期只有3-4 个月，采用基因工程抗原后效期大大延长了。

c.基因工程抗原将特异性抗原决定簇基因融合表达，表达产物包含更多的抗原决定簇，可提高 试剂盒的灵敏度，提高检出率。

d.纯化难度大。基因工程抗原的纯化技术难度较大。

     合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特点：

 a.分子量太小；

b.一般只含有一个抗原决定簇；

c.纯度高；

d.稳定性差。

    国内乙肝两对半试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，资料显示，不同厂家试剂的特异性和敏感性分别为 89.4%—99.3%,78%—89%存在较大差异。有的厂家酶标板孔间A值差大于15%；标记酶的活性及显色液的稳定比较差。使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。因此。选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。

•  选择试剂时应选择灵敏度高、特异性好、稳定性好、批间差小、操作方便省时的优良检测试剂，国家参比实验室每年对各厂家的试剂进行质量评估并定期公布评估结果，可作为选择试剂的主要依据。

•  要注意试剂的批号和出厂日期，虽然试剂的有效期多为 1年。选择刚出厂的试剂使用。

不同厂家的试剂不能混用。

    不同方法学的检测试剂，会使两对半结果出现一些不同。例如：在实际工作中常用 ELISA检测HBsAg结果为阴性，而电化学发光检测为阳性。除方法学的灵敏度外；还存在使用单抗或多克隆抗体试剂的差别。单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在差异，建议试剂厂家对剂的制备应该考虑亚型及型浓度的问题。

人elisa试剂盒