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实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两类,探针类是利用与靶细胞序列特异性杂交的探针来指示扩增产物的增加,非探针类是利用荧光染料或者特异性设计的引物来指示扩增的增加。运用该技术可以对DNA、RNA样品进行定量(包括定量和相对定量)和定性分析。
主要服务:DNA或RNA的定量分析、基因表达差异分析、基因分型。
主要技术:引物设计、RNA提取、cDNA合成、qPCR。
参数规格:
产品名称:牛源性成分(Bovine)定性PCR检测试剂盒
产品货号:CP100163
产品规格:50T
产品分类:PCR法
产品运输:低温运输
产品保存:-20℃保存
产品有效期:一年
产品特点:本产品就是根据保守区设计引物而开发的高灵敏荧光定量 PCR 产品。
PCR反应鉴定——PCR反应条件:
循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
预变性 | 94℃ | 5 min | 1 |
变性 | 94℃ | 10 sec | 30-40 |
退火 | 50-65℃ | 20 sec | 30-40 |
延伸 | 72℃ | 30 sec/kb | 30-40 |
终延伸 | 72℃ | 5 min | 1 |
实验过程:
一、试剂准备
1. DNA模板
2.对应目的基因的特异引物(在PCR反应中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制,而不能从无到有,凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA,一般20多bp,需要根据你的模板链设计。因此,扩增不同的基因需要设计不同的引物)
3.10×PCR Buffer
4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5.Taq酶
二、操作步骤
1.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1(10pM) 2μl
引物2(10PM) 2μl
Taq酶(2U/μl) 1μl
DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl
加ddH2O至 50 μl
视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油。
2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上,执行扩增。一般:在93℃预变性3-5min,进入循环扩增阶段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循环30-35次,zui后在72℃ 保温7min。
3.结束反应,PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃保存。
4.PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100μlLuFang进行抽提反应混合液,以除去石蜡油;否则,直接取5-10μl电泳检测。
实验注意事项:
1)RT-PCR可以检测组织、细胞、血液、细菌等很多材料,不同的样本有不同要求,实验前请充分沟通确认实验方案和样本情况;
2)客户尽可能提供实验的背景信息、物种、基因准确的名称和ID号;
3)客户尽量不要提供DNA或RNA样品。
4)样本保存于液氮或干冰,也可以保存于Trizol液中。
使用方法:
一、样品DNA的制备
用自选方法提取细菌样品DNA。注意:DNA纯化方法是决定检测灵敏度的关键因素。如果不能很好纯化样品DNA,后面的PCR再灵敏也不能提高整体检测灵敏度。
二、制备O157:H7标准曲线(以10-10E6这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体病毒做阳性对照,只提供没有传染性的、可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。
1. 标记6个离心管,分别为6,5,4,3,2和1号。
2. 用带芯枪头分别加入45 μL超纯水(用带芯枪头,下同)。
3. 先将本试剂盒提供的阳性对照用TE缓冲液或超纯水10倍梯度稀释到10E7拷贝/μL(注:请不要将本试剂盒提供的标准品一次性稀释至10E7拷贝/μL,建议每次稀释10倍,梯度稀释至10E7拷贝/μL)。
4. 在6号管中加入5 μL 10E7拷贝/μL的O157:H7阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得10E6拷贝/μL的阳性对照。
5. 换枪头,从6号管中取5 μL溶液到5号管中,充分震荡1分钟,得10E5拷贝/μL的阳性对照。
6. 换枪头,从5号管中取5 μL溶液到4号管中,重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。
7. NC管中不加任何阳性对照。
8. 从1-6号管中分别取5 μL和待测样品一起进行定量PCR(见下步),每个样品做3次重复。PCR后得到每个阳性对照稀释样品的荧光PCR Ct值,并以之为纵轴,以浓度的对数值为横轴,绘制标准曲线。
水黏结杆菌2号染色体开放阅读框55抗体Human CLL1(Collectin Liver 1) ELISA Kit人磷脂转移蛋白β(PITPNB)免疫试剂盒
江西弯曲嗜酸菌2号染色体开放阅读框57抗体Human CHD5(Chromodomain Helicase DNA Binding Protein 5) ELISA Kit人磷脂酰乙(PEth)免疫试剂盒
Marisediminicola2号染色体开放阅读框29抗体Human CK-13/KRT13(CytokeRatin 13) ELISA Kit人磷脂酰肌抗体IgG(PI IgG)免疫试剂盒
阿魏侧耳3号染色体开放阅读框21抗体Human CGα(Chorionic Gonadotropin Alpha Polypeptide) ELISA Kit人磷脂酰肌抗体(IgM)免疫试剂盒
太平洋大洋杆状菌1号染色体开放阅读框74抗体Human CHGB(Chromogranin B) ELISA Kit人磷脂酰肌蛋白聚糖3(GPC-3)免疫试剂盒
猴假单胞菌补体C1q和肿瘤坏死因子相关蛋白10抗体Human CHRM2(Cholinergic Receptor, Muscarinic 2) ELISA Kit人磷脂爬行酶1(PLSCR1)免疫试剂盒
弗雷德里克斯堡假单胞菌1号染色体开放阅读框93抗体Human CK-20/KRT20(CytokeRatin 20) ELISA Kit人磷脂酶D2(PLD2)免疫试剂盒
匍枝根霉1号染色体开放阅读框94抗体Human CK-18/KRT18(CytokeRatin 18) ELISA Kit人磷脂酶A2受体抗体(IgG)免疫试剂盒
皱褶假丝酵母1号染色体开放阅读框96抗体Human CFL2(Cofilin 2, Muscle) ELISA Kit人磷脂酶A2(PL-A2)免疫试剂盒
大肠埃希菌1号染色体开放阅读框41抗体Human CCKAR(Cholecystokinin A Receptor) ELISA Kit人磷酸乙酸磷酸酶(PGP)免疫试剂盒
Deinococcus1号染色体开放阅读框144抗体Human C5b(Complement Fragment 5b) ELISA Kit人磷酸烯式酮酸羧激酶(PCK)免疫试剂盒
哈茨木霉4号染色体开放阅读框3抗体Human CCK-8(Cholecystokinin 8) ELISA Kit人磷酸烯酮酸羧激酶,线粒体(PCK2)免疫试剂盒
淡紫拟青霉组织蛋白酶S抗体Human C5c(Complement C5 Convertase) ELISA Kit人磷酸葡萄糖酸脱氢酶(PGD)免疫试剂盒
镰刀菌死亡诱导蛋白抗体Human CALD(Caldesmon) ELISA Kit人磷酸酶PP2A癌性抑制物(CIP2A)免疫试剂盒
发酵乳杆菌前列腺雄激素抑制信号蛋白1抗体Human CA6(Carbonic Anhydrase VI) ELISA Kit人磷酸激酶1(PGK1)免疫试剂盒
球毛壳磷酸化心肌肌钙蛋白抗体Human CA5B(Carbonic Anhydrase VB, Mitochondrial) ELISA Kit人磷酸肌3激酶(PI3K)免疫试剂盒
牛源性成分(Bovine)定性PCR检测试剂盒曲霉属Aspergillus│sp. 质量规格:>99%,BR凋亡相关蛋白激酶试剂盒桔梗皂苷D2
灰红头孢Cephalosporium│roseogriseum 质量规格:>98%,BR凋亡相关半肽酶4试剂盒甲氧基醉椒素
拟盘多毛孢Pestalotiopsis│sp. 质量规格:>99%,BR凋亡蛋白酶激活因子1试剂盒黄杨酮碱
棒杆菌属Corynebacterium│sp. 质量规格:>99%,分子生物学级淀粉状蛋白β试剂盒槲皮素7-O-α-L鼠李糖苷
柠檬色游动球菌Planococcus│citreus 质量规格:>98%电子转运黄素蛋白-泛醌氧化还原酶/电子转运黄素蛋白脱氢酶试剂盒槲皮素-3-龙胆二糖甙
腐皮镰孢Fusarium│solani 质量规格:>99%,BR电子转移黄素蛋白β肽试剂盒诃子林鞣酸
黑曲霉Aspergillus│niger 质量规格:>98%,BR电压门控通道抗体试剂盒海柯皂苷元
詹氏乳杆菌Lactobacillus│jensenii 质量规格:>98%,BR电压门控通道试剂盒覆盆子酮葡萄糖苷
赤杆菌Erythrobacter│sp. 质量规格:分析标准品第八因子相关抗原试剂盒二钠