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人心型脂肪酸结合蛋白酶联免疫试剂【工作原理】
心型脂肪酸结合蛋白(heart-type fatty acid binding protein,H-FABP)是心肌细胞中富含的一种小分子(15KDa)细胞质蛋白质,参与脂质体内平衡。H-FABP含量在骨骼肌中比心肌中低10倍,在肾脏、肝脏和小肠中含量更低。心肌损伤后,H-FABP释放至细胞外,出现于血流中,血浆H-FABP大量升高与梗塞面积间也有良好的相关性。所提供的ELISA Kit是典型的夹心法酶联免疫吸附测定试剂盒(ELISA)。预先包被的抗体为多克隆抗体。检测相抗体也为多克隆抗体,经*(biotin)标记。样品和*标记抗体先后加入酶标板孔反应后,PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应;经过PBS或TBS的*洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的待测因子呈正相关。
人心型脂肪酸结合蛋白酶联免疫试剂【注意事项】
1. 开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。
2. 配制各种试剂时,切记混匀!
3. 用户在初次使用试剂盒时,应将各种试剂管离心数分钟,以便试剂集中到管底。
4. 建议所有标准品、样本都做双份检测。
5. 要严格避免操作过程中酶标板干燥。干燥会使酶标板上生物成份迅速失活!
6. 为免交叉污染,要避免重复使用手中的吸头和试管。
【样品的准备和保存】
样品如果不立即分析,应分装后冷冻保存,且避免反复冻融。
血清——用干净试管收集血液,室温凝固2小时或4℃过夜,离心1000×g 10分钟,收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
细胞培养、组织匀浆、体液——离心去除沉淀,立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
B.*标记抗体工作液:在使用前2小时内准备。
1. 根据每孔需要0.1ml计算总的用量(实际配制时应多配制0.1-0.2ml)。
2. 按10ul*标记抗体加抗体稀释液990ul的比例配制工作液。轻轻混匀。
C.亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)工作液的准备:在使用前1小时内准备。
1. 根据每孔需要0.1ml计算总的用量(实配时应多配制0.1-0.2ml)。
2. 按10ul亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)加ABC稀释液990ul的比例配制工作液。轻轻混匀。
D. TMB显色工作液的准备:在使用之前30分钟,按TMB显色液A 9份加 TMB显色液B 1份的比列配制TMB显色工作液
【操作程序】
1. 确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目。
2. 将倍比稀释的标准品各0.1ml依次加入一排7孔中,1孔只加样品稀释液的作为对照。处理后的标本按100ul每孔加入。
3. 酶标板加上盖,37℃反应90分钟。
4. 反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体;或甩去酶标板内液体,再对着吸水纸拍几下。洗涤2次。
5. 将准备好的*抗体工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反应60分钟。
6. 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤3次,每次浸泡1分钟左右。
7. 将准备好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反应30分钟。
8. 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤5次,每次浸泡1-2分钟左右。
9. 按每孔0.09ml依次加入已在37℃平衡30分钟的TMB显色液,37℃避光反应,反应过程中,要经常的观察,当肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色,后3-4孔差别不明显时,即可加入TMB终止液0.1ml/孔。(显色反应zui长不要超过30分钟)。
10. 用酶标仪在450nm测定O.D.值。
11. 根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了N倍,其实际浓度应该×N。