常用标准

（1）GB/T 4789.3-2003 食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定

（2）GB 4789.3-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数

（3）GB 4789.28-2013 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求

（4）GB 4789.1-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则

（5）GB 4789.41-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 肠杆科检验

（6）GB/T 27405-2008 实验室质量控制规范 食品微生物检测

（7）GB/T 16294-2010 医药工业洁净室（区） 沉降菌的测试方法

常见问题及解答

1、食品中大肠菌群的检测有两个标准三种方法，该如何选择呢？

A：依据产品标准的项目单位

1.1 若单位为CFU/g，则选择GB 4789.3-2016第二法（平板计数法）

1.2 若单位为MPN/g，则选择GB 4789.3-2016第一法（MPN计数法）

1.3 若单位为MPN/100g，则选择GB/T 4789.3-2003。

2、MPN法3个适宜的连续稀释度该怎样选择？

A：依据产品标准的项目标准值

2.1 若标准值为＜3.0MPN/g，则选择0.1g、0.01g、0.001g三个稀释度。

2.2 若标准值为≤30MPN/100g，则选择1g、0.1g、0.01g三个稀释度。

样品采集

怎样采样，才能使样品具有代表性？

这里将样品分为两类：预包装食品和散装食品或现场制作食品

（1）对于预包装食品

① 应采集相同批次、独立包装、适量件数的食品样品，每件样品的采样量应满足微生物项目检验的要求。

② 独立包装小于、等于1000g 的固态食品或小于、等于1000mL 的液态食品，取相同批次的包装。

③ 独立包装大于1000mL 的液态食品，应在采样前摇动或用无菌棒搅拌液体，使其达到均质后采集适量样品，放入同一个无菌采样容器内作为一件食品样品；大于1000g 的固态食品，应用无菌采样器从同一包装的不同部位分别采取适量样品，放入同一个无菌采样容器内作为一件食品样品。

（2）对于散装食品或现场制作食品

用无菌采样工具从 n 个不同部位现场采集样品，放入 n 个无菌采样容器内作为 n 件食品样品。每件样品的采样量应满足微生物项目检验单位的要求。

培养基制备过程容易出现问题解答

1、异常现象一：培养基不凝固

原因分析：

①制备过程中过度加热；

②低pH造成培养基酸解；

③称量不正确；

④琼脂未*溶解；

⑤培养基成分未充分混匀。

2、异常现象二：pH不正确

原因分析：

①制备过程中过度加热；

②水质不佳；

③外部化学物质污染；

④测定pH时温度不正确；

⑤pH计未正确校准；

⑥脱水培养基质量差。

3、异常现象三：颜色异常

原因分析：

①制备过程中过度加热；

②水质不佳；

③pH不正确；

④外来污染；

⑤脱水培养基质量差。

4、异常现象四：产生沉淀

原因分析：

①制备过程中过度加热；

②水质不佳；

③脱水培养基质量差；

④pH计未正确控制。

5、异常现象五：培养基出现抑制/低的生长率

原因分析：

①制备过程中过度加热；

②脱水培养基质量差；

③水质不佳；

④使用成分不正确，如：成分称量不准，添加剂浓度不正确；

⑤制备容器或水中的有毒残留物。

6、异常现象六：选择性差

原因分析：

①制备过程中过度加热；

②脱水培养基质量差；

③配方使用不对；

④添加成分的加入不正确，例如加入添加成分时培养基过热或添加浓度错误；

⑤添加剂污染。

7、异常现象七：污染

原因分析：

①不适当的灭菌；

②无菌操作技术存在问题；

③添加剂污染。

实验过程

1、平板法VRBA倾注完，待琼脂凝固后为什么需要加3-4mL的覆盖层？

A：因为大肠菌群是需氧及兼性厌氧的，再加一层琼脂相当于造就一个半厌氧环境，促进兼性厌氧菌的生长，同时抑制其他菌的生长。除此之外，还有防止菌落蔓延的作用，防止迁徙性菌落对菌落计数构成影响。例如一些变形杆菌就会有迁徙现象，从而导致菌落长成一片无法区分。在表面多覆盖一层培养基就可以避免这种情况的发生。

2、GB 4789.3-2016平板法验证菌落如何挑取？

A：分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落数。按比例挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,少于10个菌落的挑取全部典型和可疑菌落。假如在1:10的平板上可疑大肠菌群有10个，典型大肠菌群有6个。证实实验应该按照可疑跟典型5:3的比例进行挑取，移种于BGLB肉汤管内。

结果处理

1、所有稀释度都不在计数范围内怎么办？

这种情况一般都是低稀释度的平板都小于15CFU，这种情况就是以低稀释度的平板菌落数乘以验证试验的比例来计算。例如10倍稀释的两个平板上菌落数分别为10、8，菌落数为10的平皿挑取10个菌落复发酵中有8个菌落产气，菌落数为8的平皿挑取8个菌落复发酵中有7个菌落产气，则计算过程是这样的：（10*8/10+8*7/8）/2*10=75CFU/g（mL）。

2、连续两个稀释度的四个平皿的菌落数都在计数范围内怎么办？

这个需要参考菌落总数检测国标里7.1.2里的公式计算。我们需要先计算每个平皿的验证后的菌落数，再代入公式计算即可。例如10倍稀释度两个平皿菌落数为120和125，100倍稀释度两个平皿的菌落数为17和16，经过复发酵验证产气的管数分别为7、8、8、8，则我们先计算每个平皿上的菌落数分别为120*7/10=84，125*8/10=100，17*8/10=13.6（我们计14），16*8/10=12.8（我们计13），然后将84、100、14、13四个数代入公式：（84+100+14+13）/（2+0.2）*10=959，结果应报告960CFU/g（mL）。

3、只有一个稀释度的一个平皿的菌落数在计数范围，其他均不在计数范围怎么办？

这样我们只需要复发酵验证这一个平皿即可，根据这一个平皿的菌落数进行报告。例如10倍稀释度两个平皿菌落数为160和142，100倍稀释度两个平皿的菌落数为12和13，则我们只需要从菌落数为142CFU的平皿里挑取10个菌落进行复发酵验证即可，假如共有7支发酵管阳性，则应计算142*7/10=99.4，结果报告990CFU/g（mL）。

注意：对于结果检出的平板或试管需要经过无害化处理（121℃灭菌30分钟）方能弃去，防止对环境造成污染。