硝基呋喃类药物的危害及检测目的

硝基呋喃类药物常见的有呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林4种。硝基呋喃类药物是一种广谱抗生素，对一些革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、某些真菌和原虫具有抑制和杀灭作用，且价格低廉，通常被用于预防和治疗畜禽养殖业和水产业中因感染沙门氏菌和大肠埃希菌而产生的疾病。然而，硝基呋喃类药物具有潜在的致畸、致癌、致突变作用，其滥用会造成动物体内兽药残留，危害食用人群的身体健康。2020年我国农业农村部公告第250号，也将硝基呋喃类药物列入《食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单》中。

本文阐述了如何将硝基呋喃类药物代谢物从样品基质中分离提取出来，并经过净化后，转化成液质联用仪可以检测的形式。以酸解、衍生、提取、净化为重点，依据国标GB/T 21311-2007，为检测人员和相关领域研究人员提供一定的参考。

检测项目：硝基呋喃类药物代谢物

应用范围：动物源性食品/肌肉/内脏/鱼/虾/蛋/奶/蜂蜜/肠衣

高效液相色谱-串联质谱法

方法原理：样品经盐酸水解，邻硝基苯（甲醛）过夜衍生，调pH值7.4后，用乙酸乙酯提取，正己烷净化。分析物采用高效液相色谱-串联质谱定性检测，采用稳定同位素内标法进行定量测定。

前处理仪器：组织捣碎机；分析天平（感量0.0001g和0.01g）；均质器（10000 r/min）；振荡器；恒温箱；pH计（测量精度±0.02 pH单位）；离心机（10000 r/min）；氮吹仪；旋涡混合器；容量瓶（1 L，100 mL，10 mL）；具塞塑料离心管（50 mL）；刻度试管（10 mL）；移液枪（5 mL，1 mL,100 μL）。

检测仪器：HPLC-MS/MS+ESI源

试样制备

1.肌肉、内脏、鱼和虾

从原始样品取出有代表性样品约500 g，用组织捣碎机充分捣碎混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。将试样置于-18 ℃冷冻避光保存。

2.肠衣

从原始样品取出有代表性样品约100 g，用剪刀剪成边长<5 mm的方块，混匀后均分成两份，分别装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。将试样置于-18 ℃冷冻避光保存。

3.蛋

从原始样品取出有代表性样品约500 g，去壳后用组织捣碎机搅拌充分混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。将试样置于4 ℃冷藏避光保存。

4.奶和蜂蜜

从原始样品取出有代表性样品约500 g，用组织捣碎机充分混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。将试样置于4 ℃冷藏避光保存。

前处理方法

1.水解和衍生化

肌肉、内脏、鱼、虾和肠衣

称取约2 g试样（精确至0.01 g）于50 mL塑料离心管中，加入10 mL甲醇-水混合溶液（1+1，体积比），振荡10 min后，以4000 r/min离心5 min，弃去液体。残留物中加入10 mL 0.2 mol/L盐酸，用均质器以10000 r/min均质1 min后，再依次加入混合内标标准溶液100 μL，邻硝基苯（甲醛）溶液100 μL，涡动混合30 s后，再振荡30 min，置37 ℃恒温箱中过夜（16 h）反应。

蛋、奶和蜂蜜

称取约2 g试样（精确至0.01 g）于50 mL塑料离心管中，加入10 mL～20 mL 0.2 mol/L盐酸（以样品*浸润为准），用均质器以10000 r/min均质1 min后，再依次加入混合内标标准溶液100 μL，邻硝基苯（甲醛）溶液100 μL，涡动混合30 s后，再振荡30 min，置37 ℃恒温箱中过夜（16 h）反应。

2.提取和净化

取出样品，冷却至室温，加入1 mL～2 mL 0.3 mol/L磷酸钾（1 mL盐酸溶液加0.1 mL磷酸钾溶液），用2.0 mol/L氢氧化钠调pH 7.4（±0.2）后，再加入10 mL～20 mL乙酸乙酯（乙酸乙酯加入体积与盐酸溶液体积一致），振荡提取10 min后，以10000 r/min离心10 min，收集乙酸乙酯层。残留物用10 mL～20 mL乙酸乙酯再提取一次，合并乙酸乙酯层。收集液在40 ℃下用氮气吹干，残渣用1 mL 0.1%甲酸水溶液溶解，再用3 mL乙腈饱和的正己烷分两次液液分配，去除脂肪。下层水相过0.20 μm微孔滤膜后，取10 μL供仪器测定。

3.混合基质标准溶液的制备

肌肉、内脏、鱼、虾和肠衣

称取5份约2 g的阴性试样（精确至0.01 g）于50 mL塑料离心管中，加入10 mL甲醇-水混合溶液（1+1，体积比），振荡10 min后，以4000 r/min离心5 min，弃去液体。残留物中加入10 mL 0.2 mol/L盐酸，用均质器以10000 r/min均质1 min后，按照定容浓度：1、5、10、50、100 ng/mL，分别加入混合中间标准溶液或混合标准工作溶液，再加入混合内标标准溶液100 μL，余下操作同肌肉、内脏、鱼、虾和肠衣的衍生、提取和净化步骤。

蛋、奶和蜂蜜

称取5份约2 g的阴性试样（精确至0.01 g）于50 mL塑料离心管中，加入10 mL～20 mL 0.2 mol/L盐酸（以样品*浸润为准），用均质器以10000 r/min均质1 min后，按照定容浓度：1、5、10、50、100 ng/mL，分别加入混合中间标准溶液或混合标准工作溶液，再加入混合内标标准溶液100 μL，余下操作同蛋、奶和蜂蜜的衍生、提取和净化步骤。

国标解读及注意事项

1.由于硝基呋喃类药物进入动物体内后，会快速转化成为对应的代谢物，且代谢物稳定、残留时间长、毒性更强，因此动物源性食品中都以检测硝基呋喃类代谢物为主。动物饲料中才会检测硝基呋喃类原药。

2.由于硝基呋喃类代谢物见光容易分解，所以在样品制备和前处理过程中尽量避光操作。

3.由于硝基呋喃类代谢物的分子质量比较小，需要*行衍生化反应，增加分子质量，从而提高质谱检测灵敏度。

4.硝基呋喃类代谢物和蛋白质结合紧密，需要酸解使其游离出来，同时进行衍生化反应。

5.特殊基质虾干、海米等，pH值比较高，在酸解过程中适当提高盐酸浓度，保证酸解效果；带有裹粉类的食品，在生产和加工过程中会产生SEM，甲醇水洗涤后仍会有残留，容易造成假阳性结果，在结果判定时需要注意这个问题。

6.由于硝基呋喃类代谢物检测的特殊性，需要制作基质加标流程曲线进行定量分析。在阴性试样中，根据定容浓度加入相应的外标，其余操作同样品前处理方法一致。

7.在建立液质联用检测方法时，需要用到硝基呋喃类代谢物衍生后的四种标准物质，以及相对应的四种同位素内标。

参考文献

GB/T 21311-2007 动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法 高效液相色谱/串联质谱法

图1 肌肉、内脏、鱼、虾和肠衣中硝基呋喃类代谢物残留量测定的前处理流程图

图2 蛋、奶和蜂蜜中硝基呋喃类代谢物残留量测定的前处理流程图

 表1  硝基呋喃类代谢物信息表