污水处理养殖粪便设备

畜禽粪便中重金属如Cu、Zn、As等间接促进了抗生素抗性基因的产生.如表 4所示，某些重金属和抗生素具有相同的抗性机制，因此，在重金属抗性增加的同时，可能会导致抗生素抗性的产生或加强(Ji et al., 2012).如Berg等(2010)通过未培养的方法，证明了Cu对四环素和*的抗性基因具有联合选择压力.Silveira等(2014)研究了从各种环境中筛选出的肠球菌(Enterococcus)中Cu抗性基因和ARGs的联合转移情况

结果发现，微生物的Cu抗性对肠球菌中的多重耐药性产生了选择压力，证明了Cu抗性基因(tcrB和cueO)在肠球菌中的水平转移，并且这种Cu抗性的水平转移同时伴随着*、四环素、*、*、*、氨苄*等多种抗性的转移.Nishino等(2007)研究了多重耐药菌沙门氏菌中双组分调控系统BaeSR，结果发现，当调节因子baeR高效表达时，能够显著提高Salmonella enterica的多重耐药性和Cu、Zn的抗性，baeR控制了mdtABC操纵子和tolC、acrD的表达，mtdABC和acrD同时决定了Salmonella enterica的多重耐药性和Cu、Zn的抗性.

也就是说，Cu和Zn的选择压力均会导致baeR的高效表达，进而影响mdtABC操纵子和tolC、acrD的表达，从而导致Salmonella enterica抗生素抗性的增加.因此，在考察畜禽粪便土地利用对土壤中抗生素抗性基因的影响时，不仅应该考虑抗生素类物质，而且应考虑Cu、Zn、As等微量元素的影响.

表4 具有相同抗性机制的重金属和抗生素

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土壤中土著细菌含有许多抗性基因，现在用于大规模生产的抗生素生产菌基本都来自于土壤.但是，同畜禽粪便相比，土壤细菌自身携带的抗性基因无论在数量上还是在自身属性上均有很大区别.例如，在数量上，Yang等(2010)采用实时定量PCR方法，虽然没有在美国洛杉矶国家公园土壤中检测到tetB、tetC、tetW和tetO，但这些基因却大量存在于其它受农业活动影响的276个土壤样品中.

其次，从抗性基因属性来看，土著细菌所携带的抗性基因大多同微生物正常的新陈代谢在一起，使微生物在低浓度的抗生素条件下生存，很少同水平转移因子结合在一起(Baquero et al., 2009).但是，在较大的环境选择压力下，如畜禽粪便中所含的抗生素和重金属，这些抗性基因会进行复制，并转移到转座子和质粒上以获得更高的抗性水平.而这些转座子和广谱的质粒或者其他的基因扩散因子，进入更大范围的微生物，从而使抗性基因得到了传播(Martínez2007 et al., 2007).

　　目前有关施用畜禽粪便的土壤中重金属抗性基因的分布特征尚未见报道，但是施用含重金属的有机粪肥后，土壤中微生物的重金属和抗生素抗性均产生了明显的变化.如Berg等(2010)的研究表明，含Cu有机肥进行土地利用后，Cu的加入不仅增加了土著微生物的Cu抗性，而且间接增加了具有Cu抗性微生物的抗生素抗性.

　　总之，现阶段畜禽粪便土地利用过程中抗生素、重金属、抗生素抗性基因的分布特征研究多集中在单因素，不仅缺乏复合污染条件下抗生素抗性基因的迁移与传播机制研究，而且重金属抗性基因的迁移转化有待进一步明确，同时迫切需要深入研究畜禽粪便的施用频率、施用量、施用时间和土壤类型、植物类型等对土地利用过程中抗生素和重金属及其抗性基因赋存与转归的影响.

　　5 抗生素和重金属抗性基因产生、转移、分布的微生物学机理

　　抗生素抗性基因在不同环境中相互影响，并呈现一定的性.已有调查显示，从未使用过抗生素的环境中，抗生素抗性基因的数量却在逐年增加(Segawa et al., 2013)，这同抗性基因的传播方式和途径息息相关.

　　现阶段发现的微生物对抗生素产生抗性的机制主要有4种(Allen et al., 2010)：细胞通透性障碍、外排泵、抗性突变和抗生素失活机制.不同抗生素产生的抗性机制不一样.以四环素抗性基因为例(图 1)，迄今为止主要有35种类型的四环素抗性基因，包括外排泵机制24种、抗生素失活机制1种、核糖体保护蛋白机制(抗性突变机制)10种(McArthur et al., 2013).一般在研究抗生素抗性基因分布的时候，往往选择特定几种抗性基因来研究，以四环素抗性基因为例，外排泵机制选择tetG、tetA、tetC等较多，酶失活机制选择tetX

核糖体保护蛋白机制选择tetM和tetQ较多.这几类四环素抗性基因在环境中丰度一般比较高，具有代表性.不同环境中并不是存在所有抗性机制的抗性基因，这可能同定量PCR方法有一定的检测限有关.如Zhu等(2013)采用定量PCR方法检测到了28种四环素抗性基因中的22种.随着分子生物学技术的不断发展，新的抗性基因也不断被发现.如Su等(2014)利用功能基因组学的方法，筛选了不同土壤环境样品中多种抗生素抗性基因，结果发现，同已发现的抗生素抗性基因相比，氨基酸水平上只有2%的抗性基因的相似性在90%以上，67%以上抗性基因的相似性低于60%.这说明环境中还有很多尚未被认识的抗性基因.另外，微生物不断进化，人们相信新的抗生素抗性机制也会随之产生(Karisetty et al., 2013).

图 1 四环素抗性基因

水体、土壤和工业废弃物中的许多微生物都表现出了对重金属的抗性.同抗生素抗性基因一样，重金属抗性基因存在于染色体、质粒和转座子，有时两者连接在一起.由于不同重金属的电化学性质不一样，微生物对其抗性机制也有较大差别.现阶段主要有6种重金属抗性机制：细胞通透性障碍、细胞内外螯合、外排泵、酶解毒和降低受体敏感性.目前针对环境样品中重金属抗性的研究比较多，但是针对重金属抗性基因的研究比较少，大多是针对某个具体的微生物.

以Cu为例，研究较多的是黄单胞杆菌属(Xanthomonas)中的抗性基因变化情况.如Behlau等(2013)研究了同柑橘相关的黄单胞杆菌属中Cu抗性基因的变化情况，证明了Cu抗性基因复杂的来源.Abou-Shanab等(2007)的研究结果表明，各种重金属的抗性基因都是大量存在于从含重金属Ni丰富的土壤及庭荠根际中筛选出的G+菌和G-菌.