N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)试剂盒

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase, NAG)试剂盒说明书 （货号：WS2350F 分光法 24 样） 一、产品简介： N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG，EC 3.2.1.52）是溶酶体中的一种酸性水解酶，广 泛存在于各种组织、体液和细胞中，该酶活性变化与机体某些病理状态密切相关。 NAG 分解 4-硝基酚-β-N-乙酰氨基葡萄糖生成对-硝基*酚（PNP），在 415nm 处检测 该产物的升高速率，来计算 NAG 活力大小。 二、试剂盒组分与配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 30mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部，再加 入 2.1mL 蒸馏水，充分溶解备用，用 不完的试剂仍-20℃保存； 试剂二 液体 6mL×1 瓶 4℃保存 试剂三 液体 35mL×1 瓶 4℃保存 标准品 粉剂×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 三、所需的仪器和用品： 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、台式离心机、水浴锅或恒温培养箱、 可调式移液器。 四、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本的制备： ① 组织样本：取约 0.1g 组织（水分充足的样本取 0.5g），加入 1mL 提取液，进行冰浴 匀浆。15000rpm， 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本，按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 提取。 ② 细菌或细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细 胞，加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；15000 rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】若增加样本，可以按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 提取。 ③ 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 415nm，蒸馏水调零。 ② 在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 20 20 试剂一 80 蒸馏水 80 试剂二 100 100 迅速混匀，37℃保温 30min 试剂三 600 600本试剂盒仅供科研使用 2 混匀，取全部上清液于 1mL 玻璃比色皿中，415nm 处测定吸光值 A， ΔA=A 测定-A 对照（每个测定管需设一个对照管）。 【注】：1.若ΔA 在零附近徘徊，可延长 37℃孵育时间 T（如增至 1 小时或更长），或增加加样体积 V1 （如增至 50μL，则试剂二相应减少）或增加取样质量 W（如增至 0.2g）。则改变后的 T 和 V1 和 W 需代入公式重新计算。 2.若 A 测定大于 1.5 或△A 大于 1.5，可缩短 37℃孵育时间 T（如减至 10min 或更短）或减少 加样体积 V1（如减至 10μL，则试剂二相应增加）。则改变后 T 和 V1 需代入公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线：y = 0.0187x + 0.0095；x 为标准品质量（nmol），y 为吸光值ΔA 。 2、按样本蛋白浓度计算： 单位定义：每毫克组织蛋白每分钟产生 1nmol 对-硝基*酚（PNP）定义为一个酶活性单位。 NAG 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0095) ÷0.0187]÷(V1×Cpr)÷T=89.1×(ΔA-0.0095)÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 单位定义：每克组织每分钟产生 1nmol 对-硝基*酚（PNP）定义为一个酶活性单位。 NAG 活性(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA-0.0095) ÷0.0187]÷(W×V1÷V)÷T=89.1×(ΔA-0.0095)÷W 4、按细菌或细胞密度计算： 单位定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1nmol 对-硝基*酚（PNP）定义一个酶活单位。 NAG 活性(nmol/min/104cell)=[(ΔA-0.0095) ÷0.0187]÷(500×V1÷V)÷T=0.18×(ΔA-0.0095) 5、按液体体积计算： 单位定义：每毫升样本每分钟产生 1nmol 对-硝基*酚（PNP）定义为一个酶活性单位。 NAG 活性(nmol/min/mL)=[(ΔA-0.0095) ÷0.0187]÷V1÷T=89.1×(ΔA-0.0095) V----加入提取液体积，1mL； V1----加入反应体系中样本体积，20μL=0.02mL； W----样本质量，g； 500----细胞或细菌总数，500 万； T----反应时间，30min； PNP 对分子质量----139.11。 Cpr----样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒； 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（1mg/mL）：向标准品 EP 管里面加入 1ml 蒸馏水。 2 把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 mg/mL。也可根据实际 样本来调整标准品浓度。 3 在 EP 管加入：20μL 标准品+180μL 试剂二+600μL 试剂三，混匀，取 200μL 至 96 孔板中，于 415nm 下读取吸光值。 4 根据结果制作标准曲线。