ATP含量试剂盒(酶法),微板法

ATP含量试剂盒(酶法),微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 ATP 含量测定试剂盒说明书 （货号：WS7580W 微板法 96 样） 一、产品简介： 三磷酸腺苷（ATP）是生物体内能量转换最基本的载体,是生物体内最直接的能量来源， 测定 ATP 含量并且计算能荷，能够反映能量代谢状态。 三磷酸腺苷（ATP）在己糖激酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶混合酶的作用下，使 ATP 水解 并伴随着 NADPH 的生成，通过检测 340nm 下 NADPH 的增加量，进而计算得到 ATP 的 含量。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂×1 支 4℃保存 临用前甩几下或离心，使粉剂落 入底部，再加 1.1mL 蒸馏水备用。 试剂二 粉剂×1 支 -20℃保存 临用前甩几下或离心，使粉剂落 入底部，再加 1.1mL 蒸馏水备用。 试剂三 16mL 液体×1 瓶 4℃保存 试剂四 粉剂×1 支 4℃保存 临用前甩几下或离心，使粉剂落 入底部，再加 1.1mL 蒸馏水备用。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、恒温培养箱、可调式移液枪、研钵和蒸馏水。 四、ATP 含量检测： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织加入研钵中，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心 10min，取上清液，置冰上待测。 【注】：也可以按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例提取。 ② 细菌/真菌样本： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心弃上清；取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液； 冰浴超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3S，间隔 10S，重复 30 次）；12000rpm，4℃离心 10min，取上清液，置冰上待测。 【注】：也可按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例进行提取。 ③ 液体样本：澄清的液体直接检测；若浑浊则离心后取上清检测。 ④ 高蛋白含量样本： ④-1：称取约 0.1g 组织加入研钵中，加入 1mL 蒸馏水，进行匀浆，转至 EP 管中，于 95℃水浴中煮 5min，取出冷却至室温后于 12000rpm，室温离心 10min，上清液待测。 ④-2：或称取约 0.1g 组织加入研钵中，加入 0.5mL 高氯酸（0.5M），进行冰浴匀浆， 8000rpm，4℃离心 10min，取全部上清至另一 EP 管中，再加入与上步所取上清液等体 积的 KOH 或 NaOH（0.5M）混匀，使整个液体 PH 近中性，若澄清直接检测，若浑浊 则 8000rpm，4℃离心 5min 后取上清液测定，此时整个上清液体积记为 V3。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30 min 以上，调节波长到 340nm。本试剂盒仅供科研使用 2 ② 在 96 孔板中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 样本 10 试剂一 10 试剂二 10 试剂三 160 混匀，室温（25℃）下，5min后于340nm 处读取A1值。 试剂四 10 混匀，室温（25℃）下，反应15min 于340nm处读取A2值，ΔA=A2-A1。 【注】若ΔA 差值在零附近，可增加样本量 V1（如 40μL，则试剂三相应减少）。 则改变后的 V1 需代入公式重新计算。 五、结果计算： 1、按样本鲜重计算： ATP 含量(μmol/g 鲜重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×106]÷(W×V1÷V)=6.35×ΔA÷W 2、按细菌/细胞密度计算： ATP 含量(μmol/104 cell)=[ΔA÷(ε×d)×V2×106]÷(500×V1÷V)=0.013×ΔA 3、液体中 ATP 含量计算： ATP 含量(μmol/mL)=[ΔA÷(ε×d)×V2×106]÷V1=6.35×ΔA 4、高蛋白样本中 ATP 含量计算： ATP 含量(μmol/g 鲜重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×106]÷(W×V1÷V)=6.35×ΔA÷W ATP 含量(μmol/g 鲜重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×106]÷(W×V1÷V3)=6.35×ΔA÷V3÷W ε---NADPH的摩尔吸光系数为6.3×103L/mol/cm； d---光径距离，0.5cm； V---提取液体积，1mL； V1---样本体积，10μL=0.01mL； V2---反应总体积，200μL=2×10-4L； ATP分子量---551.14； V3---高蛋白组织样本最终上清液总体积，mL； W---样本质量，g; 检测线范围---0.06μmol/mL-4μmol/mL。