NAD激酶(NADK)试剂盒,微板法

NAD激酶(NADK)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 NAD 激酶（NAD kinase, NADK）试剂盒说明书 （货号：WS4580W 微板法 96 样） 一、产品简介： NADK（EC 2.7.1.23）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是目前所发现 的生物体内惟一能够催化 NAD+磷酸化生成 NADP+的酶，因此，NAD 激酶在合成 NADP(H) 以及调节 NAD(H)与 NADP(H)的平衡上具有重要作用。 NADK 催化 NAD+磷酸化生成 NADP+；接着在 6-磷酸葡萄糖脱氢酶和 6-磷酸葡萄糖作 用下，使 NADP+还原成 NADPH。通过检测 NADPH 在 340 nm 下的增加速率。可得出 NADK 酶活性的大小。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 120mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 临用前甩几下或离心使粉剂落 入底部，再加 1.1mL 蒸馏水溶 解。 试剂二 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 临用前甩几下或离心使粉剂落 入底部，再加 1.1mL 蒸馏水溶 解。 试剂三 液体 16mL×1 瓶 4℃保存 试剂四 粉剂 mg×1 支 4℃保存 临用前甩几下或离心使粉剂落 入底部，再加 1.1mL 蒸馏水溶 解。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、低温台式离心机、可调式移液器、研钵、蒸馏水。 四、NAD 激酶（NADK）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本 称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。4℃×12000g 离心 10min，取上 清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取 ② 细菌/细胞样本： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液； 超声波破碎细菌或细胞（冰浴，300W，超声 3s，间隔 7s，重复 30 次）； 4℃×12000g 离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000:1 的比例进行提取 ③ 液体样本：直接检测，若浑浊则离心后取上清液检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm。 ② 所有试剂解冻至室温（25℃） ③ 在 96 孔板中依次加入下列试剂：本试剂盒仅供科研使用 2 试剂名称（μL） 测定管 样本 10 试剂一 10 试剂二 10 试剂三 160 混匀，25℃下孵育 5-10min 试剂四 10 混匀，25℃下立即于 340nm 处读取 A1，2min 后读 取 A2，△A=A2-A1。 【注】1. 若 A2 值大于 1.5，则可减少样本上样量 V1（如减至 5μL，则试剂三相应增加），或缩短 反应时间 T（如缩至 1min 或更短），则改变后的加样量 V1 和反应时间 T 需代入公式重新计算。 2. 若△A 在零附近徘徊，可增加样本量（如增至 20μL，则试剂三相应减少），或增加反应时 间 T（如增至 5min 或更长）。则改变后的加样量 V1 和反应时间 T 需代入公式重新计算。 五、结果计算： 1、按样本蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟生成 1μmol 的 NADP+定义为一个酶活力单位。 NADK（μmol/min/mg prot）＝[ΔA×V2÷（ε×d）×106]÷(V1×Cpr) ÷T=3.22×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算： 酶活定义：每克组织每分钟生成 1μmol 的 NADP+定义为一个酶活力单位。 NADK（μmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V2÷（ε×d）×106]÷(W× V1÷V) ÷T=3.22×ΔA÷W 3、按细菌/细胞密度计算： 酶活定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1μmol 的 NADP+定义为一个酶活力单位。 NADK（μmol/min /104 cell）＝[ΔA×V2÷（ε×d）×106]÷(500×V1÷V) ÷T=0.006×ΔA 4、按液体样本计算: 酶活定义：每毫升液体每分钟生成 1μmol 的 NADP+定义为一个酶活力单位。 NADK（μmol/min/mL）＝[ΔA×V2÷（ε×d）×106]÷V1÷T=3.22×ΔA ε---NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm； d---96 孔板光径，0.5cm； V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.01 mL； V2---反应体系总体积，2×10-4 L； T---反应时间，2 min； W---样本质量，g； 500---细菌或细胞总数，500 万； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。