NADH氧化酶(NOX)试剂盒,微板法

NADH氧化酶(NOX)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 NADH 氧化酶（NADH oxidase，NOX）试剂盒说明书 （货号：WS3080W 微板法 96 样） 一、产品简介： NADH 氧化酶（NOX，EC 1.6.99.3）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中， 可在氧气存在下，直接将 NADH 氧化为 NAD。该酶不仅参与 NAD 的再生，而且与免疫 反应密切相关。 NOX 能够将 NADH 氧化为 NAD，通过检测 NADH 于 340nm 处的下降速率，即可得 出 NADH 氧化酶活性的大小。 二、试剂盒组分与配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 试剂一 液体 100mL×1 瓶 -20℃保存 试剂二 液体 20mL×1 瓶 -20℃保存 试剂三 液体 16mL×1 瓶 4℃保存 试剂四 粉剂×1 支 4℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底 部，再加 1.5mL 蒸馏水溶解备用。 试剂五 粉剂×3 支 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底 部，每支再加 0.5mL 蒸馏水溶解 ，用不完的试剂分装后-20℃保存， 禁止反复冻融，三天内用完。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、低温台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰、蒸馏水。 四、NADH 氧化酶（NOX）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、线粒体制备（提示：整个线粒体的提取过程须保持 4℃低温环境）： ① 称取约 0.2g 组织或收集 1000 万细菌/细胞，加入 1mL 试剂一，用冰浴匀浆器或研钵冰 浴匀浆，转移至离心管后于 4℃×3000g 离心 20min。 ② 小心吸取上清液（弃沉淀）移至另一离心管中，4℃×16000g 离心 20min。用移液器移 除上清液（上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的 NOX（此 步可选做））。留下沉淀（沉淀即为线粒体）。 ③ 在沉淀（线粒体）中加入 200μL 试剂二，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超 声 5s，间隔 3s，重复 30 次），液体置于冰上用于线粒体 NOX 酶活性测定。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取，或按照细 菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 2、上机检测： 1 酶标仪预热 30min 以上，设定温度 25℃，调节波长至 340nm。 2 所有试剂解冻至室温（25℃）。 ③ 在 96 孔板中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 试剂三 160 试剂四 10 试剂五 10本试剂盒仅供科研使用 2 混匀，室温（25℃）静置 3min 样本 20 混匀，室温（25℃）立即于 340nm 处读 取 A1，5min 后读取 A2，△A=A1-A2 【注】若△A 的值在零附近，可以延长反应时间 T（如至 10min 或更长），则改变后的 反应时间 T 需代入公式重新计算。 五、结果计算： 1、按样本蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟氧化 1 nmol NADH 定义为一个酶活单位。 NOX（nmol/min /mg prot）=[ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(V1×Cpr) ÷T=643.1×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算： 酶活定义：每克组织每分钟氧化 1 nmol NADH 定义为一个酶活单位。 NOX（nmol/min /g 鲜重）=[ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(W× V1÷V)÷T=128.6×ΔA÷W 3、按细菌或细胞密度计算： 酶活定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟氧化 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 NOX（nmol/min /104 cell）=[ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.26×ΔA ε---NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm； d---96 孔板光径，0.5cm； V--- 加 入 提 取 液 体 积 ， 0.2mL ； V1--- 加 入 样 本 体 积 ， 0.02mL ； V2---反应体系总体积，2×10-4 L； T---反应时间，5min； W---样本质量，g； 500---细胞或细菌总数，500 万； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。