肌酸激酶(CK)试剂盒,微板法

肌酸激酶(CK)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 肌酸激酶（Creatine Kinase, CK）测定试剂盒说明书 （货号:WS5580W 微板法 96 样） 一、产品简介： 肌酸激酶（CK，EC 2.7.3.2）主要存在于心脏、肌肉及脑等组织中，能可逆地催化 肌酸与 ATP 之间的转磷酰基反应，在能量运转、肌肉收缩和 ATP 再生中有重要作用。 CK 催化磷酸肌酸和 ADP 生成肌酸和 ATP，通过添加的己糖激酶与 6-磷酸葡萄糖 脱氢酶复合体，依次催化 ATP 的水解与并伴随着 NADPH 的生成，通过检测 NADPH 在 340nm 处吸光值的增加即可得出 CK 酶活性的大小。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂×1 支 4℃保存 临用前甩几下，使粉剂落到底部， 再加 1.1mL 蒸馏水充分溶解。 试剂二 粉剂×1 支 -20℃保存 临用前甩几下，使粉剂落到底部， 再加 1.1mL 蒸馏水充分溶解。 试剂三 液体 16mL×1 瓶 4℃保存 试剂四 粉剂×4 支 4℃保存 临用前甩几下，使粉剂落到底部， 每支加 0.3mL 蒸馏水充分溶解。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板天平、低温离心机、可调式移液器、恒温培养箱、研钵。 四、肌酸激酶（CK）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆，转移至 EP 管中，12000rpm, 4℃ 离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。 ② 细菌/细胞样本： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液(mL)为 500~1000：1 的比例进行提取。 ③ 液体样本：直接检测；若浑浊则离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min，设定温度至 37℃，调节波长至 340nm。 ② 所有试剂可预先在 37℃条件下预温 5min，在 96 孔板中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 样本 20 试剂一 10 试剂二 10 试剂三 150本试剂盒仅供科研使用 2 【注】1.若 A 测定大于 1.5，则可减少反应时间 T（如减至 10min）再读取 A2，或减少样本加样量 V1 （如减至 5μL, 则试剂三相应增加）,则改变后的 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。 2.若△A 的值小于 0.01，则可增大样本体积 V1（如增至 80μL 或更多，则试剂三相应减少），或 延长反应时间 T（如增至 30min 或更长），则改变后的 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、按组织蛋白含量计算： 定义：37℃条件下，每毫克蛋白质在每分钟内催化产生 1nmoL NADPH 为一个酶活单位。 CK 活性(nmoL/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr)÷T=214.4×ΔA÷Cpr 2、按组织样本质量计算： 定义：37℃条件下，每克样品在每分钟内催化产生 1nmoLNADPH 为一个酶活单位。 CK 活性(nmoL/min/g 鲜重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(V1÷V×W)÷T=214.4×ΔA÷W 3、按细胞数量计算： 定义：37℃条件下，每 104个细胞每分钟内催化产生 1nmoLNADPH 为一个酶活单位。 CK 活性(nmoL/min/104 cell)=[(ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.43×ΔA 4、按液体体积计算： 定义：37℃条件下，每毫升液体在每分钟内催化产生 1nmoLNADPH 为一个酶活单位。 CK 活性(nmoL/min/mL)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷V1÷T=214.4×ΔA V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.02mL； V2---反应体系总体积，2×10-4 L； d---96 孔板光径，0.5cm； ε---NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L/moL/cm； W---样本质量，g； T---反应时间，15min； Cpr---蛋白浓度（mg/mL），建议使用本公司的 BCA 蛋白含量测定试剂盒。 37℃条件下孵育 20min， 试剂四 10 混匀，37℃条件下，立即于 340nm 处读取 A1，15min 后读取 A2，△A= A2-A1。