肌酸激酶(CK)试剂盒(定磷法),微板法

肌酸激酶(CK)试剂盒(定磷法),微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 肌酸激酶（Creatine Kinase, CK）活性测定说明书 （货号：WS2880W 微板法 96 样） 一、产品简介： 肌酸激酶（CK，EC 2.7.3.2）主要存在于心脏、肌肉及脑等组织中，能可逆地催化 肌酸与 ATP 之间的转磷酰基反应，在能量运转、肌肉收缩和 ATP 再生中有重要作用。 肌酸激酶（CK）催化三磷酸腺苷和肌酸生成磷酸肌酸，后者很快全部水解为磷酸， 但是三磷酸腺苷和生成的二磷酸腺苷仍很稳定；通过定磷试剂来测定磷酸肌酸水解出 的磷酸含量检测 CK 酶活性大小。 二、试剂盒的组成和配制： 【注】：全程操作需无磷环境；试剂配置用新枪头和玻璃移液器等，避免磷污染。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、肌酸激酶（CK）活性检测： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。 4℃×12000rpm 离 心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。 ② 细菌/细胞样本： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 ③ 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 700nm，所有试剂解冻至室温（25℃）。 ② 试剂一和二和三可按照 20:20:210 预先配成混合液（现配现用）；在 EP 管中依次加入： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 提取液 120mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉体 mg×1 支 4℃保存 用前甩几下使试剂落入底部，再加 4.2mL 蒸馏水溶解（可超声溶解）。 试剂二 粉体 mg×1 支 -20℃保 存 用前甩几下使试剂落入底部，再加 4.2mL 蒸馏水溶解（可超声溶解）。 试剂三 液体 44mL×1 瓶 4℃保存 试剂四 液体 9mL×1 瓶 4℃保存 试剂五 A:粉体 mg×2 瓶 B:液体 6.5mL×1 瓶 4℃保存 临用前在一瓶试剂 A 中加 3.24mL 的 B 液，再加41.76mL蒸馏水混匀溶解备用。 标准品 粉体 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 试剂名称（μL） 测定管 对照管 试剂一 20 20 试剂二 20 20本试剂盒仅供科研使用 2 ③ 显色反应，在 EP 管中直接加入： 【注】1.若△A 低于 0.01 可增加②歩中样本加样体积 V1(如增至 100μL，则试剂三 相应减少，总反应体系不变)，或延长 37℃ 孵育时间 T（如增至 60min）； 或增加取样质量 W；则改变后的 V1 和 T 和 W 需代入公式计算。 2.若 A 大于 1.2，可用蒸馏水对③歩中上清液稀释，则稀释倍数 D 代入公式计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 0.4836x - 0.0025，x 是标准品摩尔浓度（μmol/mL）, y 是△A。 2、按蛋白浓度计算： 定义：每小时每毫克组织蛋白产生 1μmol 磷酸肌酸的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h/mg prot)=[(△A+0.0025)÷0.4836×V2] ÷(V1×Cpr)÷T=28.12×(△A+0.0025)÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 定义：每小时每克组织产生 1μmol 磷酸肌酸的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h/g 鲜重)=[(△A+0.0025)÷0.4836×V2]÷(W×V1÷V)÷T=28.12×(△A+0.0025)÷W 4、按细菌或细胞密度计算： 定义：每小时每 1 万个细菌或细胞产生 1μmol 磷酸肌酸的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h /104 cell)=[(△A+0.0025)÷0.4836×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.056×(△A+0.0025) 5、按液体体积计算： 定义：每小时每毫升液体产生 1μmol 磷酸肌酸的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h/mL)=[(△A+0.0025)÷0.4836×V2]÷V1÷T=28.12×(△A+0.0025) V---加入提取液体积，1mL； V1---加入样本体积，0.05mL ； W---样本鲜重，g； V2---酶促反应总体积，0.34mL； T---反应时间，1/2 小时； 500---细菌或细胞总数，500 万； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（20μmol/mL）：标准品用 1mL 蒸馏水溶解。（母液需在两天内用）。 2 把母液用蒸馏水稀释成六个浓度标准品：0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2. μmol/mL。也可根据实际样本来调 整标准品浓度。 3 依据③歩中显色反应阶段测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。 试剂三 210 210 样本 50 37℃ 孵育 30min 试剂四 40 40 样本 50 混匀，8000rpm，4℃离心 5min，上清液待测。 上清液 100 100 试剂五 400 400 混匀，室温静置 10min，若浑浊则可 8000rpm，4℃ 或室温离心 5min，取 250μL 澄清液体至 96 孔板中， 于 700nm 下读取各管吸光值，△A=A 测定-A 对照（每 个样本做一个自身对照）。