Ca2+—ATP酶试剂盒,微板法

Ca2+—ATP酶试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 Ca2+ - ATP 酶活性测定说明书 （货号：WS0680W 微板法 48 样） 一、产品简介： Ca2+是细胞内重要的信号分子，细胞质基质始终维持在一个较低水平的 Ca2+浓度，Ca2+ 浓度的维持主要由 Ca2+-ATP 酶来维持，该酶可催化 ATP 水解生成 ADP 和无机磷。通过 测定无机磷的量来确定该酶活性高低。 二、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 三、试剂盒的组成和配制： 【注】：全程操作需无磷环境；试剂配置用新的枪头和玻璃移液器等，也可以用一次性塑料器皿，避 免磷污染。 四、Ca2+-ATP 酶活性检测： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。 4℃×12000rpm 离心 10min，取 上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。 ② 细菌/细胞样本： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量(104)：提取液(mL)为 500~1000：1 的比例进行提取。 ③ 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 700nm，所有试剂解冻至室温（25℃）。 ② 在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 试剂一 100 提取液 100 样本 100 试剂二 100 100 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 提取液 80mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉体 mg×1 瓶 4℃保存 用前甩几下使试剂落入底部，再加 8mL 提取液，混匀溶解备用。 试剂二 粉体×1 瓶 -20℃保存 用前甩几下使试剂落入底部，再加 15mL 提取液，混匀溶解备用。 试剂三 液体 4mL×1 瓶 4℃保存 试剂四 A:粉体 mg×1 瓶 B:液体 2mL×1 瓶 4℃保存 临用前在试剂 A 中加 1.8mL 的 B 液， 再加23.2mL的蒸馏水，混匀溶解备用。 标准品 粉体 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂本试剂盒仅供科研使用 2 37℃ 孵育 20min 试剂三 40 40 样本 100 混匀，12000rpm，4℃离心 5min，上清液待测 ③ 显色反应： 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 0.6402x - 0.0034，x 是标准品摩尔质量（μmol/mL）, y 是△A。 2、按蛋白浓度计算： 定义：每小时每毫克组织蛋白分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h/mg prot)=[(△A+0.0034)÷0.6402×V2]÷(V1×Cpr)÷T =15.93×(△A+0.0034)÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 定义：每小时每克组织分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h/g 鲜重)=[(△A+0.0034)÷0.6402×V2]÷(W×V1÷V)÷T =15.93×(△A+0.0034)÷W 4、按细菌或细胞密度计算： 定义：每小时每 1 万个细菌或细胞分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h /104 cell)=[(△A+0.0034)÷0.6402×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.032×(△A+0.0034) 5、液体中 Ca2+-ATPase 活力计算: 定义：每小时每毫升液体分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h/mL)=[(△A+0.0034)÷0.6402×V2]÷V1÷T=15.93×(△A+0.0034) V---加入提取液体积，1mL； V1---加入样本体积，0.1mL ； V2---酶促反应总体积，0.34mL； T---反应时间，1/3 小时； W---样本鲜重，g； 500---细菌或细胞总数，万； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（5μmol/mL）：标准品用 10mL 试剂一溶解。（母液需在两天内用）。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. μmol/mL。也可根据实际样本来调整 标准品浓度。 3 依据显色反应阶段测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。 上清液 50 50 试剂四 200 200 混匀，室温静置 3min，700nm 下读取各管吸光值， △A=A 测定-A 对照（每个样本做一个自身对照）。