产品及特点

牛细小病毒染料法荧光定量 PCR 试剂盒是一种传染性肠炎病毒，会引起牛之间的传染病，以高热、呕吐、白细胞严重减少和肠炎为特征，感染病毒后，病牛会迅速脱水，消瘦，眼窝深陷，被毛凌乱，皮肤无弹性，耳鼻，四肢发凉，精神高度沉郁，休克， 死亡。从病初症状轻微到严重一般不超过 2 天，整个病程一般不超过一周，发病迅速， 传播范围广，因此牛细小病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用，为此本公司开发了简单快捷的牛细小病毒染料法荧光定量 PCR 检测试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供病毒样品。
2. 根据牛细小病毒保守序列设计的专一性引物，与相关病毒无交叉反应。
3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。
4. 一管式荧光定量 PCR 检测，避免后续污染。
5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。
6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

规格及成分

成分

编号

十孔盒包装

2×qPCR MagicMix

90408

500 μL（棕色管）

荧光PCR 模板稀释液

180701

1 mL（黄盖）

牛细小病毒染料法PCR 引物混合物

14-44000yw

100 μL（白盖）

牛细小病毒染料法PCR 阳性对照

(1×10E8  拷贝/μL)

14-44000pc

50 μL（红盖）

天净沙核酸释放剂（试用装）

61202

20 次（1mL，绿盖）

使用手册

14-44000sc

1 份

运输及保存

低温运输、-20℃保存，有效期一年。

自备试剂

DNA 模板、10×ROX（根据机型决定，具体见使用方法）。

使用方法

一、稀释 PCR 阳性对照（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）

1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作为阳性对照。

2. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

1. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 模板稀释液（用带芯枪头，下同）。
2. 在  7  号管中加入  5  μL  1×10E8  拷贝/μL  的阳性对照，充分震荡  1  分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

1. 换枪头，在 6 号管中加入 5  μL  1×10E7 拷贝/μL  的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
2. 换枪头，在 5 号管中加入 5  μL  1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
3. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。二、样品 DNA 的制备
4. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照）， 一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步制备的 PCR 阳性对照的第 4号（浓度为 1×10E4  拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝）或第 5 号（浓度为 1×10E5拷贝/μL，10μL  相当于  10  万拷贝）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。如果每次制备需要 200μL 样品，则 PC 和 NC 的体积也必须是 200μL。
5. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA  提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的一管式病毒 DNAout 或其升级版柱式病毒 DNAout。本试剂盒免费赠送 20 次天净沙核酸释放剂，其使用手册可从本公司网站通过搜索产品名称天净沙核酸释放剂或产品编号 61202 下载。

三、设置 qPCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）

1. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
2. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕

后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后后加）：

成分

样品管

N+2 个

PCR 阴性

对照管

PCR 阳性

对照管（2-7 管）

2×qPCR MagicMix

10 μL

10 μL

各 10 μL

牛细小病毒染料法PCR

引物混合液

2 μL

2 μL

各 2 μL

自备 10×ROX (见注)

2 μL

2 μL

各 2 μL

N+2 待测样品 DNA 模板

6 μL

不加

不加

超纯水

不加

6 μL

不加

第 7 步所得 PCR 阳性对照

不加

不加

各 6μL（2 号样到

稀释液（2-7 号）

2 号管，3 号样到 3

号管…）

注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用ROX 作为对照，其他荧光 PCR 仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，则用水替代。

1. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行优化）。

四、数据处理

1. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的log 值，再推算出其浓度。
2. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct  值应该小于或等于30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则

为阴性，如果小于 40，则为阳性。

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