测定意义：

细胞色素P450酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。AH在P450酶系中相当于CYP2E1亚型，CYP2E1不仅参与了药物的代谢，而且还能催化多种前致癌物和前毒物的活化过程。

测定原理：

AH催化苯胺羟化后产生的4-氨基酚，进一步转变为酚-吲哚复合物，在630nm处有特征吸收峰；通过测定630nm吸光度增加速率，来计算AH活性。

自备仪器及用品：

普通离心机、超速离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、双蒸水和冰。

试剂组成和配制：

试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入100mL蒸馏水，充分溶解。

试剂二：液体×1瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入10mL蒸馏水，充分溶解。

试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入5mL蒸馏水，充分溶解。

试剂五：液体×1瓶，4℃保存。

试剂六：粉剂×1瓶（腐蚀性试剂），4℃避光保存。临用前加入10mL蒸馏水，充分溶解。

试剂七：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入10mL蒸馏水充分溶解。

标准液：液体×1瓶，10μmol/L，4℃避光保存。

粗酶液提取：

1、除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约0.5g组织，加入1mL试剂一，冰上充分研磨，10 000g 4℃，离心30min，取上清液，转移到超速离心管中。

2、粗制微粒体： 100 000g 4℃，离心60min，弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加1mL试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g离心30min，弃上清液。

4、终微粒体：向步骤3的沉淀中加试剂二0.5mL，盖紧后充分震荡溶解，即粗酶液，待测。

测定：

1. 分光光度计预热30 min以上，调节波长到630 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂三置于37℃水浴中预热30min以上。

3. 试剂五置于冰浴预冷30min以上。

4. 标准管：取0.5 mL EP管，加入100μL标准液，100μL试剂六，100μL试剂七，混匀后室温静置30min，吸取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，630 nm测定光吸收，记为A标准管。

5. 空白管：取0.5 mL EP管，加入50μL粗酶液，100μL试剂三，50μL蒸馏水，混匀后37℃水浴中保温30min；再加入100μL试剂五，混匀后冰浴5min，11000rpm，4℃，离心10min；取100μL上清液，加入新的0.5 mL EP管；再加入100μL试剂六，100μL试剂七，混匀后室温静置30min，吸取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，630 nm测定光吸收，记为A空白管。

6. 测定管：取0.5 mL EP管，加入50μL粗酶液，100μL试剂三，50μL试剂四，混匀后37℃水浴中保温30min；再加入100μL试剂五，混匀后冰浴5min，11000rpm，4℃，离心10min；取100μL上清液，加入新的0.5 mL EP管；再加入100μL试剂六，100μL试剂七，混匀后室温静置30min，吸取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，630 nm测定光吸收，记为A测定管。

AH活性计算：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

活性单位（U）定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol 4-氨基酚。

AH活性(U/mg prot)= C标准品×V标准品×（A测定管－A空白管）÷（A标准管－A空白管）×稀释倍数÷（Cpr×V样）÷T

= 0.002×（A测定管－A空白管）÷（A标准管－A空白管）÷Cpr。

（2）按样本鲜重计算

活性单位（U）定义：37℃中每克组织每分钟催化产生1μmol 4-氨基酚。

AH活性(U/g 鲜重)= C标准品×V标准品×（A测定管－A空白管）÷（A标准管－A空白管）×稀释倍数÷(V样÷V样总×W)÷T

= 0.002×（A测定管－A空白管）÷（A标准管－A空白管）÷W。

C标准品：10μmol/L；V标准品：100μL=1×10^-4L；稀释倍数： V反总÷V上清液=300μL÷100μL=3；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；V样：加入反应体系中粗酶液体积， 50μL=0.05 mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：催化反应时间（min），30min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

活性单位（U）定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol 4-氨基酚。

AH活性(U/mg prot)= C标准品×V标准品×（A测定管－A空白管）÷（A标准管－A空白管）×稀释倍数÷（Cpr×V样）÷T

= 0.002×（A测定管－A空白管）÷（A标准管－A空白管）÷Cpr。

（2）按样本鲜重计算

活性单位（U）定义：37℃中每克组织每分钟催化产生1μmol 4-氨基酚。

AH活性(U/g 鲜重)= C标准品×V标准品×（A测定管－A空白管）÷（A标准管－A空白管）×稀释倍数÷(V样÷V样总×W)÷T

= 0.002×（A测定管－A空白管）÷（A标准管－A空白管）÷W。

C标准品：10μmol/L；V标准品：100μL=1×10^-4L；稀释倍数： V反总÷V上清液=300μL÷100μL=3；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒； W ：样品质量； V样：加入反应体系中粗酶液体积， 50μL=0.05 mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：催化反应时间（min），30min。