产品描述

金担子素A（Aureobasidin A，AbA）是从丝状真菌Aureobasidium pullulans No. R106中分离出来的环酯肽类抗生素，具有很强的抗真菌能力。在较低的浓度下（0.1-0.5 μg/ml）即可对酵母产生毒性。对其敏感的真菌种类包括：出牙酵母（Saccharomyces cerevisiae）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、光滑念珠菌（Candida glabrata）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）和黑曲霉（A. niger.）。作用机制在于AbA抑制了真菌生长所依赖的肌醇磷酰胺（inositol phosphorylceramide，IPC）合成酶的活性，干扰鞘脂合成，从而进一步杀死菌株。编码IPC合成酶的基因研究较多的有来自酿酒酵母菌的AUR1 基因，以及构巢曲霉的AURA基因，两者具有同源性。通过对这些编码基因进行突变即可使得菌株对AbA产生抗性，如AUR1-C基因。

AbA非常适合用作阳性克隆子筛选用的药物选择性标记。AbA抗性也是酵母单/双杂交研究中理想的报告子。本品为溶于甲醇的AbA溶液，浓度为1 mg/ml。具体的工作浓度取决于宿主细胞的敏感度（见表1. AbA对各种酵母菌的低抑菌浓度（MIC））。

产品性质

冰袋运输。4℃保存。

操作步骤（抗AbA的酵母转化系统）

1）加入0.5 ml过夜培养的酵母到50 ml YPD培养基中（配方：1L液体培养基含有10g yeast extract，20g polypeptone， 20g D-glucose；固体培养基另外加入2%琼脂；）。

2）30℃培养约6小时，测定OD660为1～2。使用二倍体时，测定OD660为2～4。

3）1,000×g离心5分钟

4）用10 ml Solution A（配方：100 mM Lithium acetate，10 mM Tris-HCl pH 7.5，1 mM EDTA）悬浮沉淀，1,000×g离心5分钟。

5）用Solution A重悬沉淀，直到OD660为150。

6）在管内分取100 µl细胞悬浮液，30℃培养1小时。

7）加入5 μg载体（环状或线性DNA）和150 μg Carrier DNA（已经过100℃加热10分钟，并迅速冷却）。

【注】：pAUR101需使用线性DNA进行转化。使用环状DNA会降低转化效率甚至转化不成功。pAUR112和pAUR123需使用完整的质粒DNA进行转化。

8）加入850 µl Solution B（配方：取40 g Polyethylene Glycol 4000溶于100 ml Solution A充分溶解，需要现用现配），轻轻混匀。

9）30℃培养30分钟后，42℃培养15分钟。

10）室温放置10分钟。

11）5,000 rpm离心1分钟，用5 ml YPD培养基悬浮沉淀。

12）30℃培养6小时~过夜。

13）5,000~10,000 rpm离心，用1-10 ml 0.9% NaCl悬浮沉淀。

14）在YPD选择培养基平板（含有一定浓度的AbA，依菌株类型而定）上接种100 µl细胞悬液。30℃培养3-4天后转化完成。

15）挑取阳性转化子，和/或测定转化效率（以每微克质粒DNA转化的菌落数来表示）。

注意事项

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2）AbA的*工作浓度因宿主细胞不同而有差异，可根据低抑菌浓度（MIC）来确定。

表1 Aureobasidin 对各种酵母菌的低抑菌浓度

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