INVSc1菌株是专门用来做重组蛋白表达的宿主酵母,pYES2 质粒与INVSC1酵母配套使用,激活pYES2质粒的GALI启动子的转录进而启动下游重组蛋白的表达。INVScl为合子型,可直接通过 PEG/LiAc 将pYES2质粒转化进入INVSC1 细胞内。质粒pYES2的筛选标志为 URA,可用 SD-URA板进行筛选。操作方法:

1.取100ul冰上融化的INVScl 感受态细胞,依次加入预冷的目的质粒 2-5ug，CarrierDNA(95

100℃5min,快速冰浴,重复一次)10ul，PEG/LiAc 500ul并吸打几次混匀,30℃水浴 30min(15min 时翻转 6-8 次混匀)。

*备注:CarrierDNA加入请提前变性处理:25-100 5min,快速冰浴,重复一次。置于冰浴5min之内使用。

2.将管放 42℃水浴 15min(7.5 min 时翻转 6-8 次混匀)。

3.5000rpm 离心40s弃上清，ddHO400ul重悬,离心30s弃上清。

4.ddH,O 50ul 重悬,涂质粒筛选用:SD-U medium 板,29℃培养 48-96 h。

注意事项:

1.感受态细胞最好在冰上融化。

2.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3.同时转化 2-3 种质粒时可增加质粒的用量。

4.INVSC1酵母菌株对高温敏感,最适生长温度为 27-30℃:高于 31℃,生长速度和转化效率呈指数下降。

5.菌落变粉不是污染,是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后,平板上的 Adenine被酵母消耗完毕,酵母试图通过自身代谢途径合成 Adenine 以供利用,然而,有些菌株的ADE2基因被破坏。Adenine 合成途径受阻:又由于其 ADE4.5.6.7.8 基因均正常,所以造成中间产物 P-ribosvlamino imidazole(AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。

6.酵母在缺陷培养基中生长速度比 YPDA培养基慢,培养基中缺陷成分越多,生长越慢,以转化涂

板为例:涂 YPDA 平板 29℃:48h培养可见直径 1mm 克隆:涂SD 单缺平板 29℃.48-60h培养可见直径 1mm 克隆，涂 SD 双缺平板 29℃,60-80h培养可见直径 1mm 克隆，涂 SD 三缺或四缺平板平板 29℃,80-90h 培养可见直径 1mm 克隆。