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HiSeq2000测序原理采用稳定的可逆终止法边合成边测序技术，该技术使用4种含有末端阻断基团和不同荧光信号的碱基进行模板互补链合成，不仅确保了测序的高精确性和高顺序性，而且排除了由重复序列和同聚物导致的测序错误。HiSeq2000融合了的光学系统和制造工艺，采用两个激光源对流动池扫描，用4台照相机对4种碱基分别进行记录，减少了不同碱基间的信号干扰，提高了测序准确度。HiSeq2000因采用了流动池双表面成像技术，增加了流动池有效面积，从而增大了测序通量，降低了测序成本。
